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Aug 07, 2023

Expresión de metil/alquil coenzima M reductasas divergentes de arqueas no cultivadas

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1113 (2022) Citar este artículo

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Los metanógenos y las arqueas anaeróbicas oxidantes de metano (ANME) son actores importantes en el ciclo global del carbono. La metil-coenzima M reductasa (MCR) es una enzima clave en el metabolismo del metano, que cataliza el último paso en la metanogénesis y el primer paso en la oxidación anaeróbica del metano. Recientemente se han identificado genes divergentes mcr y similares a mcr en linajes de arqueas no cultivadas. Sin embargo, el ensamblaje y la bioquímica de los MCR de arqueas no cultivadas siguen siendo en gran parte desconocidos. Aquí presentamos un enfoque para estudiar MCR de arqueas no cultivadas por expresión heteróloga en un metanógeno, Methanococcus maripaludis. El promotor, la estructura del operón y la temperatura fueron determinantes importantes para la producción de MCR. Tanto el metanococo recombinante como el MCR ANME-2 se ensamblaron con el MCR huésped formando complejos híbridos, mientras que el MCR ANME-1 probado y la etil-coenzima M reductasa solo formaron complejos homogéneos. Junto con el modelado estructural, esto sugiere que los MCR de ANME-2 y metanógeno son estructuralmente similares y sus direcciones de reacción probablemente estén reguladas por la termodinámica en lugar de diferencias estructurales intrínsecas.

Los metanógenos o arqueas metanogénicas se consideran una de las primeras formas de vida microbiana en la Tierra1,2 y, junto con las arqueas anaeróbicas oxidantes de metano (ANME), desempeñan un papel fundamental en el ciclo global del carbono. En la actualidad, los metanógenos producen alrededor de mil millones de toneladas de metano al año en entornos anóxicos utilizando diversos sustratos, incluidos H2/CO2, formiato, acetato y compuestos metilados con C13, así como los descubiertos recientemente, incluidos los componentes del carbón4,5 y los alcanos de cadena larga6. En sedimentos marinos anóxicos, se estima que ~90% del metano biogénico es oxidado por ANME a CO2 utilizando una vía de metanogénesis inversa7, mitigando la liberación de metano a la atmósfera.

Todos los ANME y muchos metanógenos permanecen sin cultivar como cultivos de una sola especie. Según los metagenomas ambientales y los cultivos de enriquecimiento, los ANME están bioquímica y genéticamente estrechamente relacionados con los metanógenos y comparten un conjunto similar de enzimas para la oxidación anaeróbica de metano (AOM) en la dirección opuesta a la formación de metano8,9,10,11. ANME utiliza metano como fuente de carbono y energía y transfiere electrones del metano a bacterias sintróficas reductoras de sulfato9,12,13 o aceptores de electrones inorgánicos, como nitrato14, Fe(III)15,16,17 y Mn(IV)15 . Los ANME conocidos no constituyen un único grupo taxonómico y pertenecen a los órdenes "Ca. Methanophagales" (ANME-1) y Methanosarcinales (ANME-2 y ANME-3)10. El orden Methanosarcinales también contiene metanógenos. Los detalles fisiológicos y bioquímicos de ANME siguen siendo en gran parte desconocidos debido a la falta de cultivos puros y al lento crecimiento de los enriquecimientos8,18.

La metil-coenzima M (CoM) reductasa (MCR) es una enzima clave del metabolismo anaeróbico del metano19. Cataliza la última reacción de formación de CH4 en la metanogénesis y la primera reacción de activación de CH4 en la OMA. La reversibilidad de la reacción MCR (reacción 1) se ha demostrado experimentalmente con Methanothermobacter marburgensis MCR20. Recientemente, se propuso la alquil-coenzima M reductasa (ACR) relacionada para catalizar la oxidación de alcanos de cadena corta (p. ej., etano, propano y butano) por arqueas anaeróbicas oxidantes de alcanos (ANKA)21,22,23,24.

El complejo MCR está compuesto por un dímero de heterotrímeros (αβγ)2 con una molécula de tetrapirrol coenzima F430 que contiene Ni en cada uno de los dos sitios activos25. Cada F430 está profundamente enterrado dentro del complejo proteico y solo es accesible desde el exterior por un canal de 50 Å formado por múltiples subunidades, McrA, A', B y G o McrA', A, B' y G'26,27. El estado de oxidación Ni(I) de F430 es necesario para la actividad. La pareja Ni(II)/Ni(I) tiene un potencial redox extremadamente negativo (Eo') por debajo de ‒600 mV28 y, por lo tanto, la MCR es muy sensible al oxígeno y requiere un sistema enzimático complejo para la activación reductora dependiente de ATP29. Múltiples modificaciones postraduccionales únicas (PTM) están presentes en la subunidad McrA y ajustan la estabilidad y la actividad de MCR30,31,32. Aunque se han resuelto las estructuras cristalinas de un ANME-1 MCR33 y una etil-coenzima M reductasa (ECR)34, el ensamblaje y las propiedades bioquímicas de las enzimas ANME y ANKA siguen sin comprenderse bien. La expresión heteróloga de los genes que codifican un MCR de ANME-1 en Methanosarcina acetivorans estimuló la oxidación de metano por parte del organismo recombinante, proporcionando más evidencia del papel de estas enzimas35. Recientemente, el MCR de Methanothermococcus okinawensis se expresó heterólogamente en el metanógeno modelo Methanococcus maripaludis36. Aquí, desarrollamos aún más la expresión heteróloga de MCR en M. maripaludis que allana el camino para estudiar complejos enzimáticos de arqueas no cultivadas.

Recientes estudios de genómica ambiental han revelado muchos linajes de arqueas de metanógenos potenciales y ANME que no han sido cultivados hasta la fecha10. Aquí, investigamos la distribución de homólogos de MCR en 1070 genomas de arqueas ensamblados de la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB) con una integridad> 80% y una contaminación <10%. Un total de 307 genomas contenían los tres genes (mcrA, mcrB y mcrG) necesarios para codificar las subunidades MCR (Datos complementarios 1). En el árbol filogenético de rango normalizado basado en los 1070 genomas37, estas arqueas que contenían mcr incluían metanógenos, ANME-1, ANME-2, ANKA y otras arqueas de tipos metabólicos desconocidos y se intercalaron con linajes que no comparten estos genes ( Figura 1). La amplia distribución de los genes mcr en las arqueas respalda la hipótesis de que el metabolismo del metano es un rasgo antiguo probablemente presente en la raíz de las arqueas38,39,40.

Se identificaron un total de 307 genes mcr de 1070 genomas de arqueas, incluidos metanógenos (n = 252), clado ANME-1 (n = 5), ANME-2 (n = 20), ANKA (n = 9) y otras arqueas con metabolismo desconocido (n = 21). Los números de acceso se proporcionan en Datos complementarios 1. Sombreado de color: verde, metanógenos; púrpura, arqueas ANME-1; rojo, arqueas ANME-2; naranja, ANKA propuestos; gris, arqueas que contienen mcr con funciones desconocidas. Las estructuras de operón (mcrBDCGA, mcrBDGA o mcrBGA) están representadas por múltiples anillos fuera del árbol filogenético de rango normalizado. BDCGA (en azul), operón mcrBDCGA; BDGA (en cian), operón mcrBDGA; BGA (en magenta), operón mcrBGA; inusual (en negro), los genes mcr carecen de las tres estructuras de operón comunes reconocidas. Múltiples aciertos de un solo genoma indican la presencia de múltiples copias de mcr. Clasificación taxonómica: filo P, clase C, orden O, familia F, género G, especie S. Los linajes sin mcr se truncaron a nivel de orden.

Además de los genes estructurales, muchos operones mcr codifican dos proteínas accesorias, McrC y McrD. Si bien las funciones de McrC y D no están bien caracterizadas, se ha demostrado que McrC participa en el complejo de activación de MCR29 y McrD puede facilitar la adición de la coenzima F430 al complejo41. Se identificaron tres estructuras principales del operón mcr, mcrBDCGA, mcrBDGA y mcrBGA, que poseían una fuerte señal filogenética (Fig. 1). En particular, los genomas de metanógeno y ANME-2 contenían predominantemente los operones mcrBDCGA y mcrBDGA; mientras que los genomas ANME-1 poseían el operón mcrBGA más corto con mcrC en un locus separado (Fig. 1). Los genomas ANKA poseían principalmente uno o más operones mcrBGA y/o mcrBAG. La falta de homólogos de mcrD en los genomas de ANME-1 y ANKA puede ser emblemática de otras diferencias importantes con las enzimas de los metanógenos. Por ejemplo, contienen cofactores F430 que contienen níquel modificado, por ejemplo, F430 tiometilado de ANME-1 MCR33 y F430 dimetilado de Candidatus Ethanoperedens thermophilum MCR34.

Las duplicaciones de genes de mcr son comunes en arqueas. Entre los metanógenos, muchos genomas de los órdenes Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales tienen una copia de mcrBDCGA y una segunda copia de mcrBDGA o mcrBGA (Datos complementarios 1). En M. marburgensis, las dos isoenzimas MCR se expresan de manera diferente según las concentraciones de H242,43,44, lo que sugiere que las duplicaciones de mcr pueden desempeñar un papel en la aclimatación fisiológica a diversas condiciones de crecimiento. Por otro lado, los genomas ANKA propuestos a menudo tienen múltiples operones mcrBGA/BAG21,45,46, lo que sugiere que las duplicaciones mcr pueden haber ampliado su función del metano al metabolismo de alcanos multicarbonados.

La expresión heteróloga de MCR en M. maripaludis se optimizó sistemáticamente. En primer lugar, se comparó un promotor de histona constitutivo (PhmvA)36 con un promotor dependiente de fosfato (Ppst)47 desarrollado recientemente, que inicia la expresión tras la limitación de fosfato y separa parcialmente la expresión del crecimiento. Se agregó una etiqueta Flag-Strep2 al extremo N de McrG del operón mcrBDCGA de Methanococcus aeolicus (Fig. 2a). Sobre la base de la transferencia Western de un estudio anterior, los promotores PhmvA y Ppst produjeron MCR de M. aeolicus (MCRaeo) del 2,4 % y el 5,8 % de la proteína total, respectivamente47. Por lo tanto, el promotor Ppst fue superior y se utilizó en experimentos posteriores. En segundo lugar, se examinó el efecto de las ubicaciones de las etiquetas. La etiqueta Flag-Strep2 se añadió al extremo N de McrG (NG), al extremo N de McrB (NB) o al extremo C de McrA (CA) de MCRaeo. Las identidades de las proteínas purificadas se confirmaron mediante espectrometría de masas siguiendo SDS-PAGE (Fig. 2b). Se identificaron pequeñas cantidades de McrD además de las subunidades McrB, G, A. En los tres casos, los rendimientos de MCRaeo fueron ~6% de las proteínas celulares totales, lo que sugiere que las ubicaciones de las etiquetas no afectaron el nivel de producción de proteínas. Los espectros ultravioleta-visible (UV-vis) del MCRaeo purificado exhibieron un pico de absorción máximo a 425 nm, que era típico para la holoenzima MCR y ligeramente más bajo que el máximo de absorción del F430 extraído con metanol a 430 nm (Fig. 2c) . Según el coeficiente de extinción molar ε430nm = 22 500 M−1 cm−1 y un análisis basado en HPLC (Fig. S1 complementaria), el MCRaeo purificado con etiquetas NB o NG se ensambló completamente con F430, mientras que la etiqueta CA redujo el contenido de F430 en un 30% (Fig. 2c). Por lo tanto, las ubicaciones de las etiquetas afectaron el ensamblaje del F430, y las etiquetas NB y NG eran adecuadas para las producciones del holo-MCR. Por último, la presencia de PTM, incluidos tioglicina, 1-N-metilhistidina, 5-(S)-metilarginina y 2-(S)-metilglutamina, del McrAaeo recombinante se identificó mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS /MS) (Tabla complementaria 1). Esto indicó que nuestro sistema de expresión heterólogo dio como resultado los mismos PTM que se encontraron para los MCR de M. maripaludis y M. okinawenesis estrechamente relacionados.

a La estructura del operón mcr de M. aeolicus (mcraeo) y M. maripaludis (mcrmar). b Análisis SDS-PAGE de MCRaeo y MCRmar recombinantes purificados por cromatografía de intercambio iónico y afinidad con etiqueta Strep de M. maripaludis. Los pesos moleculares basados ​​en estándares están etiquetados a la izquierda. La etiqueta Flag-Strep2 se añadió al extremo C de McrA (CA), al extremo N de McrB (NB) o al extremo N de McrG (NG). Todas las subunidades fueron identificadas por MALDI-TOF MS y etiquetadas a la derecha. McrG1 y McrG2 representan McrG etiquetado y no etiquetado, respectivamente. c Espectros UV-visibles de MCRaeo y MCRmar recombinantes purificados (todos a una concentración de 7,5 mg mL−1) en comparación con la coenzima F430 extraída del MCR de M. marburgensis. d La abundancia relativa de MCR de M. aeolicus (en gris) frente a MCR del huésped M. maripaludis (en naranja) en cada subunidad del complejo MCRaeo recombinante purificado determinada por LC-MS/MS. Los porcentajes de proteína de M. maripaludis en la proteína total de cada subunidad están etiquetados.

Aunque el MCRaeo recombinante se ensambló en un holocomplejo, SDS-PAGE mostró que el complejo marcado con NG contenía una subunidad McrG2 extra (Fig. 2b). La espectrometría de masas identificó que McrG1 y G2 eran McrGaeo marcado con Flag-Strep2 y el huésped sin marcar M. maripaludis McrGmar, respectivamente. Este quimerismo también se observó para MCRaeo expresado con otras posiciones de etiqueta y el MCR recombinante de M. maripaludis (Fig. 2b, d). El McrG de M. maripaludis comprendía el 30 ± 6 % del McrG total independientemente de las posiciones de las etiquetas. En contraste con McrG, los análisis LC-MS/MS del complejo MCRaeo recombinante encontraron solo pequeñas cantidades de M. maripaludis McrA y McrB (Fig. 2d). Los complejos quiméricos se caracterizaron además por PAGE nativo y espectrometría de masas de proteína intacta (Fig. 3). Se observaron dos complejos (Complejo I y II) para el MCRaeo y el MCRmar recombinantes purificados con PAGE nativo (Fig. 3a). SDS-PAGE de los dos complejos encontró que diferían en la presencia de M. maripaludis McrG adicional sin etiquetar (Fig. 3b). La espectrometría de masas de proteínas intactas determinó que los complejos I y II tenían masas moleculares de 288,4 y 283,8 kDa, respectivamente (Fig. 3c y Tabla complementaria 2). En consecuencia, el complejo I coincidió con un complejo α2β2h2f2, donde α, β, h y f corresponden a M. aeolicus McrA, McrB, marcado McrG y F430, respectivamente. El complejo II emparejó un α2β2hγf2 con γ correspondiente al M. maripaludis McrG sin etiquetar (Fig. 3d). Estos resultados indicaron que McrG se une fácilmente a las subunidades McrA y B de un origen diferente.

un análisis Native-PAGE de MCRaeo y MCRmar recombinantes purificados. Ambos constructos tenían una etiqueta Flag-Strep2 añadida al extremo N-terminal de McrG. b Los dos complejos de MCRaeo se eluyeron de cortes de gel de PAGE nativo, se analizaron mediante SDS-PAGE y se tiñeron con plata. c Las masas moleculares nativas de los complejos MCRaeo I y II se determinaron como 288,4 y 283,8 kDa, respectivamente, mediante espectrometría de masas de proteína intacta. Las cargas de los picos están etiquetadas. d Modelos de los complejos I y II. A, B y Gaeo representan las subunidades McrA, McrB y McrG de M. aeolicus, respectivamente. Gmar denota el huésped sin marcar M. maripaludis McrG. La línea negra simboliza la etiqueta. F significa coenzima F430.

Las proteínas accesorias McrC y McrD están muy conservadas en los operones mcr de los metanógenos, pero a menudo están ausentes en los de ANME y ANKA. Para investigar sus funciones en el ensamblaje de MCR, se construyeron operones mcr de M. aeolicus truncados, incluidos mcrBDGA, mcrBCGA y mcrBGA. En todos los casos, la etiqueta Flag-Strep2 se agregó a la posición NG. Las expresiones de MCRaeo de los tres operones truncados produjeron complejos similares a los del operón mcrBDCGA completo (Fig. 4a, b). Los espectros UV-vis (Fig. 4c) y el análisis HPLC confirmaron el complemento completo de F430 en el MCRaeo purificado. Además, los principales PTM también estuvieron presentes (Tabla complementaria 1). Sin embargo, los niveles de expresión de los operones mcr truncados fueron aproximadamente tres veces más bajos que los del operón completo (Fig. 4d), aunque actualmente no está clara la causa de los niveles reducidos de proteína. Estos resultados demostraron que la presencia de mcrCD dentro del operón mcr no era necesaria para el ensamblaje de MCR y PTM.

un análisis SDS-PAGE del MCRaeo recombinante purificado por afinidad Strep-tag y cromatografía de intercambio iónico. Todas las construcciones tenían una etiqueta Flag-Strep2 añadida al extremo N-terminal de McrG. Las estructuras de operón están etiquetadas encima de cada carril. Los pesos moleculares basados ​​en estándares están etiquetados a la izquierda. Todas las subunidades fueron identificadas por MALDI-TOF MS y etiquetadas a la derecha. b La abundancia relativa de MCR de M. aeolicus (en gris) frente al huésped M. maripaludis (en naranja) en cada subunidad de los complejos copurificados determinada por LC-MS/MS. Los porcentajes de proteína de M. maripaludis en la proteína total de cada subunidad están etiquetados. c Espectros UV-vis de MCRaeo purificado (todo a una concentración de 7,5 mg mL−1) en comparación con la coenzima F430 extraída de MCR. d Niveles de expresión de MCRaeo recombinante determinados por transferencia Western. Las barras de error representan la desviación estándar de cuatro cultivos independientes.

Se propuso que McrC actuara en trans, es decir, no se requería la cotranscripción de mcrC con el operón mcr para su función, en base a la observación de que M. marburgensis McrC se copurificaba con el complejo de activación MCR, que estaba codificado fuera del operón mcr29. Para probar esta hipótesis, se realizaron dos experimentos desplegables. En primer lugar, los genes mcrBDCGA de M. aeolicus se expresaron con una etiqueta Flag-Strep2 en el terminal N de McrC (McrCaeo). Las subunidades McrA, B y G tanto de M. aeolicus (transcritas de un plásmido) como del huésped M. maripaludis (transcritas del genoma) se copurificaron con McrCaeo etiquetado (Fig. 5a, c), lo que sugiere que McrC interactúa directamente con ambos MCR independientemente de la cotranscripción. En segundo lugar, el M. maripaludis McrC (McrCmar) marcado con Flag-Strep2 solo se expresó a partir de un plásmido. El McrCmar etiquetado también se purificó junto con las tres subunidades MCR expresadas a partir del genoma (Fig. 5a). Además, otras proteínas no de los operones mcr se copurificaron con McrCaeo y McrCmar marcados. Estas proteínas incluían dos componentes del complejo de activación de MCR previamente identificados (componente A2 y proteína marcadora de metanogénesis 7) 29 y otras dos proteínas marcadoras de metanogénesis 3 y 17 (Fig. 5a).

a La construcción McrCaeo tenía el operón mcrBDCGA completo de M. aeolicus con la etiqueta Flag-Strep2 añadida al terminal N de McrC. La construcción McrCmar contenía solo M. maripaludis mcrC con una etiqueta Flag-Strep2 N-terminal. Las proteínas copurificadas con McrCaeo y McrCmar se separaron mediante SDS-PAGE y se identificaron mediante MALDI-TOF MS. Las proteínas solo purificadas con McrCaeo están marcadas en rojo. Además de las subunidades MCR, las proteínas copurificadas (en negrita) incluyen la proteína A2 de M. maripaludis (etiqueta de locus Mmp_0620), MMP3 (proteína marcadora de metanogénesis 3, etiqueta de locus Mmp_0154), MMP7 (proteína marcadora de metanogénesis 7, etiqueta de locus Mmp_0421), MMP17 (proteína marcadora de metanogénesis 17, etiqueta de locus Mmp_0656) y proteína de choque térmico Hsp20 (etiqueta de locus Mmp_0684). b La construcción McrDaeo tenía el operón mcrBDCGA completo de M. aeolicus con la etiqueta Flag-Strep2 añadida al terminal N de McrD. Las proteínas copurificadas con McrDaeo se separaron mediante SDS-PAGE y se identificaron mediante MALDI-TOF MS. c La abundancia relativa de MCR de M. aeolicus (en gris) frente a MCR del huésped M. maripaludis (en naranja) en cada subunidad de los complejos purificados determinada por LC-MS/MS. Los porcentajes de proteína de M. maripaludis en la proteína total de cada subunidad están etiquetados.

Dos experimentos confirmaron que McrD funciona en trans. En primer lugar, el huésped M. maripaludis McrD estaba presente en los MCR de M. aeolicus recombinantes purificados expresados ​​a partir de los operones mcr completos y truncados que carecen de mcrD (Fig. 4a). En segundo lugar, el operón de M. aeolicus que codifica una etiqueta Flag-Strep2 en el terminal N de McrD (McrDaeo) se expresó a partir de un plásmido en M. maripaludis para un experimento desplegable. Las tres subunidades de MCR de M. aeolicus y M. maripaludis se copurificaron con el McrDaeo etiquetado (Fig. 5b, c), lo que sugiere que McrDaeo interactuó con el MCR del huésped expresado a partir del genoma.

El sistema de expresión robusto se aplicó para producir MCR a partir de arqueas no cultivadas. Se seleccionaron dos ANME-1 MCR, cuatro ANME-2 MCR y un ECR para la expresión heteróloga (Tabla complementaria 3). En todos los casos, la etiqueta Flag-Strep2 se añadió al N-terminal de McrG bajo el control del promotor Ppst. La temperatura fue identificada como un factor importante para la producción de ANME MCR y ECR. A 37 °C, la temperatura óptima de crecimiento del huésped M. maripaludis, solo se detectaron niveles bajos de MCR recombinantes mediante transferencia de Western (Figura complementaria S2), aunque los números de copias de ARNm cuantificados por qRT-PCR sugirieron un nivel más alto de ARNm para el MCR de ANME-1_G37 recombinante que el MCR del huésped nativo (Fig. S3 complementaria). Dado que muchos metagenomas de ANME se obtuvieron de sedimentos de aguas profundas donde las temperaturas estaban cerca de los 2 °C, se examinó la expresión a temperaturas más bajas. Después de un crecimiento cercano a la temperatura mínima de M. maripaludis (25 °C), la expresión de ANME MCR y ECR mejoró mucho. Por ejemplo, ANME-1_BS y ANME-2b_HR1 representaron 1–1.5% de las proteínas celulares totales (Fig. S2 complementaria). Estos resultados sugirieron que los MCR y ECR de ANME eran inestables a temperaturas más altas o susceptibles a la degradación cuando se expresaban en M. maripaludis.

Las composiciones de proteínas de ANME-1_BS MCR (MCRANME-1_BS), ANME-2b_HR1 MCR (MCRANME-2_HR1) y Ca. Se estudiaron más a fondo Ethanoperedens thermophilum E50 ECR (ECRE50) (Fig. 6a). El análisis de espectrometría de masas confirmó que MCRANME-1_BS y ECRE50 purificados comprendían las tres subunidades McrA, B y G (Fig. 6b, c) sin el huésped MCR de M. maripaludis. Por el contrario, el McrG etiquetado de ANME-2b_HR1 se copurificó con las tres subunidades MCR de M. maripaludis (Fig. 6d), lo que sugiere que McrGANME-2_HR1 y MCRmar se ensamblaron en un complejo híbrido. Los alineamientos de secuencias de proteínas mostraron que el McrG de ANME-1 tiene una extensión C-terminal más larga que la de los metanógenos, ANME-2 y Ca. E. thermophilum (Fig. S4 complementaria); esta extensión puede inhibir las interacciones con el MCR metanocócico del huésped.

a Información general y estructuras de operón de MCRANME-1_BS, MCRANME-2b_HR1 y ECRE50. b–d Análisis SDS-PAGE de MCRANME-1_BS, ECRE50 y MCRANME-2_HR1 purificados producidos a partir de M. maripaludis cultivada a 25 oC. Los pesos moleculares basados ​​en estándares están etiquetados a la izquierda. Las identidades de proteínas (marcadas a la derecha) se confirmaron mediante MALDI-TOF MS. El McrGANME-2_HR1 etiquetado co-purificado con el anfitrión MCRmar. e Puntuación total (unidad de energía de Rosetta; REU) frente a gráfico I_rmsd para simulaciones de acoplamiento local de McrGANME-1_BS (azul) y McrGANME-2_HR1 (rojo) al complejo M. maripaludis McrA, B, G. La trama muestra 60.000 modelos de puntuación. El mejor modelo obtenido del acoplamiento McrGANME-1_BS tuvo un I_rmsd de 5,869 Å y una puntuación total de -4965,008. El mejor modelo obtenido del acoplamiento McrGANME-2_HR1 tuvo un I_rmsd de 1,848 Å y una puntuación total de -5133,935. Las diez puntuaciones de energía más bajas con I_rmsd < 2,5 Å están etiquetadas en el recuadro negro. f, g Modelos estructurales con el I_rmsd más pequeño en la simulación de McrGANME-1_BS (magenta, f) y McrGANME-2_HR1 (magenta, g) acoplados a M. maripaludis McrA (verde), B (cian), G (amarillo) ) complejo. Las subunidades de proteína se presentan en dibujos animados, y F430 y CoB-SH se representan en modelos de barras. Para mayor claridad, solo se muestra un sitio activo compuesto por las subunidades M. maripaludis McrA (verde), A' (amarillo), B (cian) y ANME McrG (magenta) y un F430. Los aminoácidos dentro de 8 Å que rodean a F430 se muestran como representación de superficie. h Los diez aminoácidos de McrGANME-2_HR1 dentro de 8 Å que rodean a F430 están etiquetados a la izquierda y se muestran en modelos de barras.

La base estructural de la formación del complejo híbrido MCR se analizó más a fondo mediante modelado computacional. Se construyó un modelo de homología del complejo MCR de M. maripaludis con RosettaCM48 (Fig. S5 complementaria) y RosettaDock49,50 (Fig. 6e-g) lo usó para el acoplamiento de proteínas con McrG de ANME-1_BS y ANME-2b_HR1. El acoplamiento in silico de McrGANME-2_HR1 con MCR de M. maripaludis fue exitoso con la desviación cuadrática media de interfaz más baja (I_rmsd) = 1.848 Å (Fig. 6e). En este modelo, se identificaron 10 aminoácidos de McrGANME-2_HR1 dentro de 8 Å que rodean a F430 (Fig. 6h), de acuerdo con los sitios de unión de F430 informados (Fig. S4 complementaria)26,51. Por el contrario, el acoplamiento de McrGANME-1_BS con MCR de M. maripaludis tuvo mala calidad (I_rmsd = 5.869 Å) (Fig. 6e), y no se observó una superficie de interacción dentro de 8 Å entre McrGANME-1_BS y F430 (Fig. 6f) . Estas simulaciones coincidieron con los datos experimentales de que ANME-2 y las subunidades metanocócicas MCR pueden formar un complejo híbrido, mientras que ANME-1 MCR solo se purifica como un complejo homogéneo.

En este estudio, se desarrolló un sistema de expresión de MCR robusto en M. maripaludis con una etiqueta Flag-Strep2 en el N-terminal de McrG bajo el control del promotor Ppst. Este sistema aumentó la expresión de MCR de dos a tres veces con respecto a otros promotores, como el PhmvA constitutivo, y permitió una rápida purificación de holo-MCR marcados. Usando este sistema, los MCR recombinantes se ensamblaron completamente con la coenzima F430 y contenían los PTM presentes en el MCR de M. maripaludis. Aunque el rendimiento de ANME MCR es actualmente más bajo que el MCR metanogénico, este estudio marcó un paso importante para los estudios bioquímicos y mecánicos de homólogos de MCR de arqueas no cultivadas.

Nuestra expresión heteróloga proporcionó información mecanicista sobre el ensamblaje de MCR. Previamente, propusimos un modelo de ensamblaje ordenado para la producción de MCR en M. maripaludis36. En este modelo, la transcripción del operón mcr coincidió con la traducción y el ensamblaje de las subunidades en la holoenzima madura con las PTM correctas. Aunque los experimentos informados aquí no fueron diseñados para proporcionar pruebas críticas de este modelo, sugieren que el modelo original era demasiado simplista. Por ejemplo, los genes para las proteínas accesorias McrC y McrD no se requerían en el operón para el ensamblaje completo de MCR con inserción de F430 y PTM correctos como sugería el modelo anterior. Sin embargo, el nivel de producción complejo se redujo en ~60% en M. maripaludis cuando mcrC y/o mcrD estaban ausentes del operón. Además, los experimentos desplegables demostraron que estas proteínas accesorias pueden funcionar en trans. Estos resultados sugieren que la estructura del operón puede desempeñar un papel importante, pero no es esencial para el ensamblaje de MCR, en consonancia con la falta de mcrC/D en la mayoría de los operones mcr de ANME y ANKA. En segundo lugar, aunque el quimerismo para las subunidades McrA y McrB fue pequeño como predijo el modelo de ensamblaje ordenado, McrG fue altamente quimérico y se ensambló en complejos de distintos orígenes. Es posible que durante el ensamblaje la adición de McrG sea menos selectiva que McrA y McrB. Por ejemplo, McrG podría ser la última subunidad que se une al complejo McrAB, aportando la coenzima F430. Alternativamente, McrG puede ser móvil. Después de ensamblarse inicialmente en MCR según lo predicho por el modelo de ensamblaje ordenado, se intercambia entre MCR nativos y recombinantes maduros. Será necesaria más experimentación para distinguir entre estas y otras hipótesis.

Nuestra caracterización de proteínas y el modelado estructural demostraron que ANME-2 y las subunidades MCR metanocócicas pueden formar un complejo híbrido, lo que sugiere que son estructural y bioquímicamente más similares entre sí de lo que se pensaba originalmente. Las arqueas ANME-2 pertenecen al orden Methanosarcinales, que es filogenéticamente distinto del orden Methanococcales. Aunque se ha demostrado que MCR de M. marburgensis cataliza reacciones reversibles de producción de CH4/oxidación de CH4 in vitro20 y se descubrió que ANME archaea era dominante en algunos sedimentos metanogénicos52,53,54,55, dicha reversibilidad aún no se ha probado en condiciones fisiológicas. Nuestros resultados proporcionaron evidencia adicional de que la metanogénesis y la metanotrofia están reguladas por controladores termodinámicos en lugar de diferencias intrínsecas de MCR en metanógenos y ANME.

La mayoría de los genomas de arqueas se recuperaron de la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB, https://gtdb.ecogenomic.org/). El genoma de ANME-1_BS (número de acceso FP565147) procedía de la base de datos de nucleótidos del NCBI. La CA. El genoma de Ethanoperedens thermophilum E50 se descargó del ensamblaje GenBank (número de acceso GCA_905171685.1)24. Las asignaciones taxonómicas se hicieron consistentes con la versión 95 de GTDB mediante el análisis de la divergencia evolutiva relativa37. Los genomas se analizaron con CheckM56 para comprobar su integridad y contaminación. Para este estudio se seleccionó un conjunto de 1070 genomas con integridad > 80 % y contaminación < 10 %. Los genes mcr se buscaron utilizando tblastn con Methanococcus maripaludis cepa S2 y Methanosarcina acetivorans cepa C2A MCR como secuencias de consulta. Las secuencias de sujetos identificados se excluyeron si sus valores esperados (E) eran mayores que 1e-5. Las estructuras de operón se reconocieron si los genes mcr identificados estaban ubicados en el mismo contig y cadena y la distancia entre dos genes adyacentes era menor de 250 pb.

El árbol de taxonomía del genoma se construyó utilizando Graphical Phylogenetic Analysis57, una herramienta de dibujo de árboles de línea de comandos basada en Python desarrollada por el laboratorio de Huttentower. La taxonomía y la denominación del genoma son consistentes con la versión 9537 de GTDB. Los patrones de los operones descubiertos estaban representados por múltiples anillos fuera del árbol filogenético circular. Múltiples aciertos de un solo genoma indican múltiples copias de mcr presentes en ese genoma.

Las cepas recombinantes de M. maripaludis se cultivaron anaeróbicamente a 25 o 37 °C. Las células se cultivaron en tubos de 28 mL con tapa de aluminio y tapón de caucho sellado con 5 mL de medio de formiato mínimo (McF) o medio de formiato rico (McFc, McF más 2 g L-1 de Casaminoácidos)58. El espacio de cabeza era 104 kPa de N2/CO2 (4:1, vol/vol). Los cultivos de 1,5 l se cultivaron en un medio basado en formiato McF con fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) limitante (80 μM). El inóculo se cultivó previamente en 5 ml de McFc y luego se transfirió a McF con K2HPO4 80 μM antes de inocular un volumen del 4 % en los cultivos experimentales. Se añadió puromicina (1,25 o 2,5 μg mL−1) cuando fue necesario. Antes de la inoculación, se añadió sulfuro de sodio 3 mM como fuente de azufre.

Los genes mcr se clonaron en el vector lanzadera pMEV4 con una etiqueta Flag-Strep2 bajo el control del promotor Ppst de 93 pb47. Para la expresión de proteínas, los plásmidos se transformaron en M. maripaludis S000159 utilizando el método de transformación mediado por polietilenglicol60. Los plásmidos se mantuvieron en las cepas recombinantes de M. maripaludis añadiendo 1,25 o 2,5 μg mL−1 de puromicina al medio. Las colonias de los transformantes seleccionados se verificaron por PCR y secuenciación.

Los cultivos de M. maripaludis que expresan MCRaeo o MCRmar recombinante se cultivaron a 37 °C en 1,5 l de McF con K2HPO4 80 μM hasta que alcanzaron una absorbancia a 600 nm de 0,5–0,7. La purificación de proteínas se realizó en condiciones aeróbicas. Las células se recogieron mediante centrifugación a 17.700 × g durante 20 min a 4 °C y luego se resuspendieron en 5 ml de tampón de unión que contenía Tris-HCl 100 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM y tabletas de cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Nueva York). , MO, EE. UU.). Las células se lisaron mediante sonicación (Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 100) utilizando un ciclo de 5 s ON/OFF con la salida establecida en 4 y el ciclo de trabajo establecido en 40 % durante 20 min en hielo. El lisado celular se centrifugó a 17 700 × g durante 20 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. La fracción sobrenadante se cargó en una columna que contenía 1 ml de resina Strep-Tactin Superflow Plus (IBA Lifesciences, Göttingen, Alemania) equilibrada con el tampón de unión. La columna se lavó con el tampón de unión y las proteínas se eluyeron con el tampón de elución que contenía Tris-HCl 100 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM y destiobiotina 2,5 mM. Las fracciones eluidas se desalinizaron y concentraron con un filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore, corte de peso molecular de 10 kDa) mediante centrifugación a 5000 × g durante 20 min a 4 °C y se complementaron con 4 ml de tampón A que contenía Tris-HCl 50 mM ( pH 7,6). A continuación, la solución de proteína se cargó en una columna de intercambio aniónico Q-Sepharose XK16 equilibrada con tampón A usando un sistema de cromatografía líquida NGC (Bio-Rad). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de 0 % a 100 % de tampón B (tampón A más NaCl 1 M). Las fracciones coloreadas que contenían coenzima F430 se combinaron y concentraron a 1 ml usando un filtro centrífugo de corte de 10 kDa. Las concentraciones de proteínas se determinaron con un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific).

Los cultivos de M. maripaludis que expresan ANME MCR se cultivaron a 25 °C en 1,5 l de McF con K2HPO4 80 μM hasta que alcanzaron una absorbancia a 600 nm de 0,5–0,7. La purificación de ANME MCR se realizó usando la cromatografía de afinidad Strep-Tactin como se describe anteriormente. Después de concentrar con el filtro centrífugo de corte de 10 kDa, se usaron perlas magnéticas Strep-Tactin XT (IBA Lifesciences, Göttingen, Alemania) para purificar aún más los MCR de ANME de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para la cuantificación de la proteína que contiene F430, los espectros de absorción UV-visible se registraron en un espectrómetro Agilent Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, EE. UU.) con muestras en una cubeta de cuarzo de 10 mm de paso óptico. La cantidad de F430 se calculó con un coeficiente de extinción molar ε = 22 500 M−1 cm−1 a 430 nm.

Para la extracción con F430, el MCR purificado se trató con un volumen igual de metanol al 100 % y las proteínas precipitadas se eliminaron mediante centrifugación a 17 000 × g durante 5 min. El sobrenadante que contenía F430 libre se sometió a un análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna C18 (4,6 × 100 mm, 3,5 μm) en un sistema Agilent 1260 Infinity equipado con un detector de matriz de diodos (DAD) VL+ como se describió anteriormente41 con modificaciones menores. El disolvente A era acetonitrilo al 10 % y ácido fórmico al 0,5 % en agua y el disolvente B era ácido fórmico al 0,5 % en acetonitrilo al 100 %. El caudal fue de 0,5 ml min-1 y el volumen de inyección fue de 30 μl. La elución de gradiente lineal se empleó de la siguiente manera: 0–10 % B durante 25 min, 10–100 % B durante 5 min. El espectro se registró de 260 a 640 nm. La cuantificación se basó en la curva estándar construida con F430 auténtico (Fig. S1 complementaria).

Las subunidades de MCR purificadas se separaron en geles SDS-PAGE al 4-20 % prefabricados (Bio-Rad) y luego se tiñeron con AcquaStain (Bulldog Bio) o con el kit Pierce™ Silver Stain (Thermo Fisher Scientific). Para la digestión con tripsina en gel, las bandas de gel se cortaron en trozos pequeños y luego se enjuagaron dos veces con acetonitrilo al 50 %/bicarbonato amónico 20 mM (~pH 7,5–8). Las piezas de gel se deshidrataron añadiendo 100 % de acetonitrilo y se secaron en un SpeedVac. Se añadieron varias cantidades de una solución de tripsina (0,01 µg µL−1 en bicarbonato de amonio 20 mM) hasta que los trozos de gel absorbieron totalmente la solución. Las muestras se incubaron a 37 °C durante la noche. Los péptidos trípticos se extrajeron de piezas de gel incubando dos veces con acetonitrilo al 50 %/ácido fórmico al 0,1 %. Los extractos se secaron con un SpeedVac. Se usó un protocolo similar para la digestión con pepsina en gel. Después de enjuagar las piezas de gel con acetonitrilo al 50 %/bicarbonato de amonio 20 mM para desteñirlas, las piezas de gel se enjuagaron dos veces con ácido fórmico al 0,1 % antes de deshidratarlas con acetonitrilo al 100 %. Se añadió suficiente solución de pepsina (Promega, 0,02 mg mL-1 en HCl 0,04 M) para cubrir las piezas de gel. Las muestras se digirieron a 37 °C durante la noche (16-18 h). Los péptidos se extrajeron con acetonitrilo al 50% en agua. Para la digestión de tripsina en solución, las muestras se diluyeron con bicarbonato de amonio 20 mM a 0,5–1 g L-1 y se complementaron con ditiotreitol a una concentración final de 10 mM. Las muestras se incubaron a 100 °C durante 5 a 10 min y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. A continuación, las proteínas se digirieron con tripsina en una proporción de 50:1, proteína a tripsina (p/p) durante la noche a 37 °C. A continuación, la muestra se secó en una aspiradora.

Para la identificación de proteínas, se analizó la huella dactilar de la masa peptídica (PMF) de las bandas de gel mediante un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF) Bruker Autoflex Matrix-Assisted Laser Desorción Ionización (MALDI). El compuesto matriz ácido 2,5 dihidroxibenzoico (2,5-DHBA) se disolvió en metanol al 50 % para obtener una solución de ~10 g L-1. Aproximadamente 0.5–1 μL de la solución matriz y las soluciones de muestra (F430 y péptidos trípticos) se mezclaron y depositaron en una placa de metal y se dejaron secar por completo.

Para los análisis PTM y las cuantificaciones de la abundancia relativa de subunidades MCR quiméricas, los análisis de cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) se realizaron en un espectrómetro de masas Thermo Fisher LTQ Orbitrap Elite acoplado con un sistema Proxeon Easy NanoLC (Waltham, MAMÁ). Los péptidos se resuspendieron en ácido fórmico al 0,1 % y luego se cargaron en una columna de fase reversa (columna autoempaquetada/emisor con resina Bruker MagicAQ C18 200 Å 5 µM), luego se eluyeron directamente en el espectrómetro de masas. Brevemente, la elución en gradiente de dos tampones (ácido fórmico al 0,1 % como tampón A y acetonitrilo al 99,9 % con ácido fórmico al 0,1 % como tampón B) comenzó con B al 5 %, se mantuvo al 5 % de B durante 2 min y luego aumentó al 25 % de B en 60 min, al 40 % de B en 10 min y al 95 % de B en 10 min. Se utilizó el método de adquisición dependiente de datos (DDA) para adquirir datos de MS. Primero se adquirió una exploración de MS de encuesta y luego se seleccionaron los 5 iones principales en la exploración de MS para el siguiente análisis CID y HCD MS/MS. Ambos escaneos MS y MS/MS fueron adquiridos por Orbitrap a resoluciones de 120,000 y 30,000, respectivamente. Los datos se adquirieron utilizando el software Xcalibur (versión 2.2, Thermo Fisher Scientific). La identificación de proteínas y la caracterización de la modificación se realizaron utilizando Thermo Proteome Discoverer (versión 1.3/1.4/2.2) con los programas Mascot (Matrix Science) o SEQUEST (Thermo). Los espectros de péptidos modificados se inspeccionaron adicionalmente para verificar la precisión de las asignaciones. Para la cuantificación de la abundancia relativa, se extrajeron y combinaron las áreas de los picos cromatográficos de los péptidos identificados pertenecientes a la misma subunidad MCR. La abundancia relativa se calculó mediante comparación directa de las áreas máximas combinadas (Datos complementarios 2).

Para la espectrometría de masas de proteína intacta, el MCR purificado se preparó a una concentración de 10 μM en acetato de amonio 200 mM (pH 7,6). Los espectros se adquirieron usando un instrumento Bruker Solarix FT-ICR-MS de 12 T. La muestra se introdujo en el instrumento mediante nanoelectrospray con puntas emisoras de sílice fundida de 30 μm (New Objective, Inc.) a un caudal de 300 nL min−1. La óptica de iones se optimizó para la transmisión de iones de alta m/z ajustando todas las frecuencias de RF a sus valores más bajos (octupolo 2,0 MHz, celda de colisión 1,4 MHz y transferencia 1,0 MHz) y utilizando un tiempo de vuelo de 3 ms. Los espectros se suavizaron utilizando un filtro Savitzky-Golay en Bruker DataAnalysis. Las asignaciones de estado de carga y las masas desconvolucionadas se determinaron manualmente mediante técnicas estándar. Brevemente, para cada una de las relaciones m/z medidas, la masa se calculó como masa = (m/z)zz, donde z es la carga. Para el Complejo I, los picos se atribuyeron a z de 28–32. Para el Complejo II, los picos se atribuyeron a z de 28–31. Las masas reportadas son entonces los promedios de los valores para cada relación m/z, y la desviación estándar se calculó a partir de la variación de las masas calculadas.

Después de la separación de las proteínas en geles SDS-PAGE prefabricados al 4-20 % (Bio-Rad), se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno activado con metanol (PVDF). La unión no específica se bloqueó con leche al 5 % en solución salina tamponada con fosfato y Tween 20 al 0,1 % (PBST) durante 1,5 ha temperatura ambiente. A continuación, las membranas de PVDF se incubaron con anticuerpos primarios (dilución 1:1000; nº de catálogo A8592, Sigma-Aldrich) contra la etiqueta FLAG durante 1,5 h a temperatura ambiente y se lavaron tres veces durante 15 min con PBST. A continuación, se desarrollaron membranas de PVDF utilizando el sustrato de peroxidasa de rábano picante occidental (HRP) para una detección quimioluminiscente mejorada (n.º de catálogo 32132; Thermo Fisher Scientific). Como se informó anteriormente47, la intensidad relativa de cada banda inmunorreactiva se estimó con ImageJ, donde se confirmó una respuesta lineal en el rango utilizado.

La extracción de ARN y qRT-PCR se realizaron como se describe47. Los cebadores se diseñaron en base a las secuencias de ADN de los genes mcrA y ANME-1_G37 mcrB de M. maripaludis utilizando el software Thermo Fisher Primer Express v3.0.1, con una temperatura de fusión de 60 °C. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: 5ʹ-GTTCACCCTTCCCTTGCATG-3ʹ (M. maripaludis mcrA-forward); 5ʹ-TGTTGATGTCGATTAAGAATCTGCT-3ʹ (M. maripaludis mcrA-reverso); 5ʹ-TCGTTAACCTGACCATTCGGA-3ʹ (G37 mcrB-adelante); 5ʹ-CCGCGGATTACCATTCCTTT-3ʹ (G37 mcrB-reversa). Se crearon curvas estándar con diluciones en serie de 10 veces entre 109 y 105 copias por reacción. Para qRT-PCR, se usaron 30 ng de ARN total para cada reacción de PCR. Todas las muestras se ajustaban a la curva estándar y la eficiencia de amplificación fue del 97 % con un R2 de 0,99.

RosettaCM, un método mejorado para el modelado comparativo, se utilizó para obtener las estructuras optimizadas48. El MCR de M. maripaludis se modeló utilizando MCR de Methanopyrus kandleri (código PDB 1E6V), Methanosarcina barkeri (código PDB 1E6Y), Methanothermobacter thermautotrophicus (código PDB 1HBM), Methanothermobacter marburgensis (código PDB 3POT, 5A8R), Methanothermobacter wolfeii (código PDB 5A8K , 5A8W), una arquea no cultivada (código PDB 3SQG), Methanothermococcus thermolithotrophicus (código PDB 5N1Q), Methanotorris formicicus (código PDB 5N28) y Methermicoccus shengliensis (código PDB 7NKG) como plantillas. Los modelos de ANME-2_HR1 McrG se basaron en MCR de Methanosarcina barkeri MCR (código PDB 1E6Y), Methanothermobacter thermautotrophicus (código PDB 1HBM), Methanothermobacter marburgensis (código PDB 3POT, 5A8R), Methanothermobacter wolfeii (código PDB 5A8K, 5A8W), y Methermicoccus shengliensis (código PDB 7NKG) como plantillas. Las búsquedas de acoplamiento local se realizaron utilizando RosettaDock (Rosetta versión 3.12)49,50, y se generó una estructura inicial a partir de la estructura de entrada preempaquetada con perturbaciones gaussianas aleatorias de 3 Å para traslación y 8° para rotación ("-docking:dock_pert 3 8"). La biblioteca de rotámeros predeterminada se agregó con rotámeros aromáticos chi1 y chi2 adicionales ("-ex1 -ex2aro"). Los socios de acoplamiento definidos por ID de cadena se aseguraron de que ANME McrG se moviera alrededor del trímero de M. maripaludis McrA, B y A'. ("-acoplamiento:socios ABD_C"). Se produjeron alrededor de 60.000 modelos en cada ejecución de acoplamiento ("-nstruct 60000").

Una serie de medidas de precisión estructural se utilizan regularmente para medir el rendimiento del acoplamiento, según lo definido por los evaluadores de Evaluación Crítica de Interacciones de Proteínas (CAPRI)61. I_rmsd se define como la desviación cuadrática media (RMSD) de los átomos pesados ​​en los residuos de la interfaz después de la superposición de esos mismos residuos, donde la interfaz se define como todos los residuos con una distancia intermolecular de 8 Å como máximo. Clasificamos nuestros resultados de acoplamiento en función de si lograron un embudo de acoplamiento. Según los criterios definidos por CAPRI, un modelo con I_rmsd < 1,0 Å se consideró de alta calidad, 1,0 Å < I_rmsd < 2,0 Å se consideró de calidad media y 2,0 Å < I_rmsd < 4,0 Å se consideró de calidad aceptable. Las estructuras se visualizaron y ajustaron en PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, versión 2.5, Schrödinger).

El número de muestras para cada experimento se proporciona en las leyendas de las figuras y en la Información complementaria. Los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 9 y los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están disponibles en el documento y en los archivos de información complementaria. Los geles y transferencias occidentales originales sin recortar de longitud completa utilizados en el manuscrito se muestran en la figura complementaria S6. Los datos brutos de espectrometría de masas para la cuantificación de la abundancia relativa se incluyen en los Datos complementarios 2. Los datos brutos para el trazado de figuras se incluyen en los Datos complementarios 3. Se puede acceder a los plásmidos utilizados en este estudio en Addgene con los códigos de acceso 192763, 192764, 192765, 192766 , 192767, 192768, 192769, 192770, 192771, 192772, 192773, 192774, 192775, 192776, 192777, 192778.

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Agradecemos a Steven Mansoorabadi (Universidad de Auburn) por sus valiosos debates y a Saw Kyin (Instalación de espectrometría de masas y proteómica de Princeton) por algunos de los análisis de espectrometría de masas de proteínas. La construcción de plásmidos y el análisis bioinformático fueron respaldados por una subvención de ExxonMobil Research and Engineering Company a WBW y ECD, y la caracterización de proteínas purificadas fue respaldada por una subvención del Departamento de Energía de EE. UU. (DE-SC0018028) a WBW y ECD. El análisis de espectrometría de masas nativa fue respaldado por una subvención de instrumentación 1S10 OD025118. Thermo Orbitrap Elite y FT-ICR recibieron además el apoyo de las subvenciones S10RR028859 y S10OD025118 para el Centro de Proteómica y Espectrometría de Masas de la Universidad de Georgia.

Departamento de Microbiología, Universidad de Georgia, Athens, GA, EE. UU.

Nana Shao y William B. Whitman

EMTEC IT, ExxonMobil Technical Computing Company, Annandale, NJ, EE. UU.

Yu Fan

Departamento de Química, Universidad de Georgia, Athens, GA, EE. UU.

Chau-Wen Chou, Robert V. Williams y I. Jonathan Amster

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Auburn, Auburn, AL, EE. UU.

Shadi Yavari y Evert C. Duin

Ciencias de la Energía, ExxonMobil Technology & Engineering Company, Annandale, NJ, EE. UU.

Stuart M. Brown y Yuchen Liu

Ciencias Biomédicas, ExxonMobil Technology & Engineering Company, Annandale, NJ, EE. UU.

Ian J. Drake

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NS, YL, ECD y WBW diseñaron la investigación. NS realizó experimentos de caracterización y purificación de proteínas y genética. CWC realizó la mayoría de los análisis de espectrometría de masas de proteínas. YF y SMB realizaron análisis bioinformáticos y modelos estructurales de proteínas. SY realizó el experimento desplegable de McrCmar. RVW realizó la espectrometría de masas de proteína intacta en el laboratorio de IJAIJD realizó los experimentos qRT-PCR. Todos los autores analizaron los datos. NS, YL y WBW escribieron el manuscrito, que fue editado por todos los autores.

Correspondencia a William B. Whitman o Yuchen Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Alfred Spormann, Jennifer Glass y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Zhijuan Qiu y Eve Rogers. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Shao, N., Fan, Y., Chou, CW. et al. Expresión de metil/alquil coenzima M reductasas divergentes de arqueas no cultivadas. Commun Biol 5, 1113 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04057-6

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Recibido: 06 mayo 2022

Aceptado: 30 de septiembre de 2022

Publicado: 20 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04057-6

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