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Aug 05, 2023

Evolución de la funcionalidad enzimática en la flavina

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1042 (2023) Citar este artículo

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Entre los mecanismos moleculares de adaptación en biología, la diversificación funcional enzimática es indispensable. Al permitir que los organismos amplíen sus repertorios catalíticos y adopten químicas fundamentalmente diferentes, los animales pueden aprovechar o eliminar sustancias recién descubiertas y xenobióticos a los que están expuestos en nuevos entornos. Aquí, exploramos las monooxigenasas que contienen flavinas (FMO) que son esenciales para la desintoxicación de xenobióticos. Empleando un enfoque de paleobioquímica en combinación con técnicas de enzimología, revelamos el conjunto de sustituciones históricas responsables de la diversificación funcional de la familia en tetrápodos. Sorprendentemente, algunos reemplazos de aminoácidos diferencian un FMO multitarea ancestral en una monooxigenasa más especializada mediante la modulación del intermediario oxigenante de flavina. Nuestros hallazgos corroboran una premisa en curso de que la función enzimática depende de un subconjunto de residuos que no se limita al núcleo del sitio activo.

Las monooxigenasas que contienen flavina (FMO) son enzimas y activos clave en el arsenal de desintoxicación de vertebrados1,2. Los FMO son generalmente conocidos por su capacidad para convertir moléculas que contienen heteroátomos en sus óxidos solubles en agua y fácilmente excretables3. A diferencia de las monooxigenasas4 del citocromo P450 que contienen hemo más específicas, las FMO pueden acomodar una plétora de sustratos dentro de sus sitios activos5. Además, también catalizan pasos clave en la activación de fármacos antiinflamatorios y anticancerígenos6,7 y están implicados en la síntesis endógena de sustancias esenciales, incluida la taurina8. Para todas estas oxidaciones, los FMO emplean oxígeno molecular (O2) y NADPH como donante de hidruro. Los FMO humanos están relacionados con enfermedades y trastornos, siendo la trimetilaminuria, comúnmente conocida como síndrome del olor a pescado, el ejemplo más conocido causado por mutaciones en un gen que codifica FMO9,10.

El genoma humano codifica cinco parálogos de FMO (FMO1–5) con uno adicional descrito como un pseudogen (FMO6)11. Curiosamente, esta disposición de cinco parálogos se conserva en prácticamente todos los tetrápodos. Los FMO 1–4 comparten esencialmente las mismas propiedades catalíticas al realizar las reacciones canónicas descritas para la familia: oxidaciones de sulfuro y amina (en adelante, S/N o heteroátomo)8,12. Por el contrario, durante mucho tiempo se consideró que FMO5 era un FMO13 "pseudoactivo". Fue recién en 2016 cuando Fiorentini et al. demostraron que el FMO5 humano podía realizar una química fundamentalmente diferente al insertar un átomo de oxígeno en el enlace C-C de las cetonas y los aldehídos, una reacción conocida como oxidación de Baeyer-Villiger (en adelante, BV)14. Las dos químicas diferentes, oxidaciones S/N y BV, se logran mediante distintos mecanismos catalíticos mediados por un intermedio reactivo oxigenante común, la C4a-(hidro)peroxiflavina, a menudo definida como un "arma amartillada" en la literatura FMO15,16 (Fig. . 1). Las oxidaciones S/N operan a través de un mecanismo de sustitución electrófilo compartido con el intermediario de flavina protonada atacando el sustrato rico en electrones15. Por el contrario, la reacción BV implica la forma desprotonada de la peroxiflavina C4a con la formación de un aducto tetraédrico, el intermedio de Criegee, entre el intermedio de flavina oxigenante y el sustrato. La oxigenación de BV impone arreglos estructurales exigentes en el sitio activo para acomodar las especies formadas durante la catálisis y la migración de un centro de carbono17. Nuestro trabajo anterior sobre la reconstrucción de los FMO de mamíferos sugiere que las distintas químicas S/N y BV ya se definieron en los mamíferos y presumiblemente en la aparición de cada clado parálogo, lo que implica la existencia de dos variedades de FMO, una dedicada a S/N oxidaciones (FMO1–4) y el otro a oxidaciones BV (FMO5)18,19.

La estructura molecular recurrente representa el resto isoaloxazina del cofactor FAD donde R corresponde a la cola de ribitiladenosina. E significa enzima. Primero, el FAD oxidado (E-FAD) es reducido por NADPH. La enzima reducida (E-FADH2) reacciona fácilmente con el O2 formando la enzima oxigenante intermedia C4a-flavina(hidro)peróxido (E-FADOO(H)). A partir de aquí son posibles dos mecanismos, la oxidación S/N o la oxidación BV, ambas seguidas de la posterior liberación de H2O y NADP+. En ausencia de sustrato, la enzima se somete a un ciclo inútil de producción de peróxido de hidrógeno llamado desacoplamiento.

La reconstrucción de secuencias ancestrales (ASR) combinada con metodologías bioquímicas y biofísicas ha demostrado ser una estrategia poderosa para revelar las causas históricas y físicas de la función de las proteínas20,21. La evolución de estrategias para lidiar con sustancias nocivas y tóxicas ha sido crucial para la supervivencia de todas las formas de vida. Sobre la base de este principio, razonamos que los FMO tetrápodos serían un estudio de caso perspicaz para aprender cómo la funcionalidad de la enzima se diversifica a lo largo de la evolución (es decir, oxidaciones S/N vs. BV). Los FMO son enzimas catalíticamente complejas. La catálisis depende de un grupo protésico (el FAD), un cosustrato (oxígeno molecular), un donador de electrones (NADPH), el sustrato y la matriz proteica (fig. 1). En este trabajo, rastreamos las sustituciones históricas que colectivamente afinan la interacción de estos muchos actores catalizadores22,23. Para los FMO, la diversidad funcional es causada por una red de residuos fuera del sitio activo, que modula la formación del intermediario oxigenante de flavina.

La historia evolutiva de los FMO de vertebrados se infirió mediante la máxima verosimilitud y los métodos bayesianos que emplean un conjunto de datos representativo que incluye secuencias de todos los vertebrados terrestres y peces óseos como grupo externo (Figs. 1 y 2 complementarias). Los FMO evolucionaron desde una secuencia de una sola copia en los primeros vertebrados con mandíbula hasta la disposición de cinco/seis parálogos en los mamíferos y otras clases importantes de animales. Como informamos anteriormente, este estallido de parálogos coincide con la aparición de tetrápodos18. Teniendo en cuenta el perfil funcional de mAncFMOs18 y FMOs24 existentes, se predijeron las actividades de los clados (Fig. 2a). Esto evidenció la existencia de dos trayectorias funcionalmente divergentes desde el ancestro común de todos los tetrápodos FMO hasta los parálogos existentes. Se podrían prever tres hipótesis igualmente parsimoniosas que explican la divergencia funcional, S/N frente a oxidaciones BV. Primero, el antepasado tetrápodo solo podía oxigenar heteroátomos y la capacidad de realizar oxidaciones BV surgió dentro del clado FMO5. A priori, este sería el escenario más probable considerando la actividad canónica de las OMF25. Alternativamente, el ancestro de los tetrápodos era promiscuo teniendo ambas actividades, y después del evento de duplicación, las enzimas se especializaron con el tiempo. Por último, el antepasado de los tetrápodos solo era capaz de realizar oxidaciones BV y, después de un evento de duplicación, se introdujeron los cambios que permitían las oxigenaciones S/N en el linaje FMO1–4.

a Filogenia colapsada de FMO de vertebrados con mandíbula con los ancestros objetivo en los nodos: (1) tAncFMO1–5, (2) tAncFMO5, (3) tAncFMO1–4 y (4) tAncFMO1–3 (círculos amarillos). Los clados están coloreados según la actividad del ancestro mamífero: oxidación S/N (azul), oxidación BV (naranja). No se dispone de confirmación experimental para la actividad de FMO4. Las siluetas representadas representan el tetrápodo ancestral (por Dmitry Bogdanov (vectorizado por T. Michael Keesey) bajo CC BY-SA 3.0) y actinopterygii (pez con aletas radiadas). La barra de escala representa las sustituciones por sitio. b Cinética de estado estacionario para tAncFMO1–4 hacia NADPH (línea roja, KM = 15,7 ± 1,8 μM) y NADH (línea azul, KM = 90 ± 17,6 μM). Se usó sulfuro de metil-p-tolilo (MPTS) como sustrato. Las velocidades observadas se obtuvieron siguiendo el cambio de absorbancia a 340 nm. Los datos se presentan como valores medios y las barras de error corresponden a SD (n = 3 experimentos independientes). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c Ensayos de conversión con los tres conjuntos de sustratos para probar las actividades de oxidación S/N y BV. Los FMO ancestrales de mamíferos (mAncFMO18,19) se incluyeron en el análisis. Las barras representan los valores medios de conversión y los puntos los valores de cada experimento (n = 2 experimentos independientes). Las oxidaciones S/N se muestran en azul, mientras que las oxidaciones BV se muestran en naranja. Los datos de origen se proporcionan en la Tabla complementaria 4.

Con el objetivo de comprender el camino hacia la divergencia funcional, decidimos resucitar a los ancestros antes e inmediatamente después de la expansión familiar. Se seleccionaron específicamente cuatro nodos para su caracterización experimental: tAncFMO1–5, tAncFMO5, tAncFMO1–4 y tAncFMO1–3 (Fig. 2a). Se determinó que todos los ancestros tenían la misma longitud (532 aminoácidos) y se reconstruyeron con alta confianza (probabilidades posteriores generales (\(\overline{{PP}}\)) > 0,94) (Fig. 3 complementaria). tAncFMO1-5 (\(\overline{{PP}}\) = 0,95) es el ancestro anterior al primer evento de duplicación (que abarca todos los parálogos de FMO de tetrápodos), mientras que tAncFMO5 (\(\overline{{PP}}\) = 0,96 ) y tAncFMO1–4 (\(\overline{{PP}}\) = 0.94) son sus parálogos hijos, ancestros de cada linaje funcionalmente diverso. Dentro del clado FMO1–4 ocurrieron más eventos de duplicación, el primero de ellos originó el clado FMO4 y tAncFMO1–3 (\(\overline{{PP}}\) = 0.95) que también resucitó. A partir de este ancestro (tAncFMO1–3), el grupo FMO2 fue el siguiente en surgir, seguido de FMO1 y FMO3, y este último se duplicó aún más únicamente en mamíferos para dar lugar a FMO6, un pseudogen en humanos21. Como el objetivo de la ASR es recuperar el fenotipo de las moléculas extintas más que su secuencia precisa, se debe tener en cuenta la incertidumbre en la reconstrucción26. Por lo tanto, también se obtuvieron las secuencias ancestrales alternativas (Alt_tAncFMOs). Estos muestran la combinación de los segundos mejores estados en todos los sitios ambiguamente reconstruidos27 (ver Métodos).

Todos los nodos seleccionados podrían expresarse como proteínas unidas a la membrana y, tras la purificación, mostraron las propiedades espectrales típicas de las enzimas que contienen flavina (Fig. 4 complementaria). Los ancestros mostraron muy buenas estabilidades térmicas (\(\bar{{T}_{m}}\) \(\sim\) 60 °C, Tabla complementaria 1), comparables a las de los AncFMO de mamíferos19. Sin embargo, en este caso la presencia de la coenzima NAD(P)+ oxidada no provocó ningún efecto en los valores de Tm. Primero, confirmamos que los tAncFMO resucitados exhibieron las características cinéticas esperadas para un FMO tetrápodo típico. Por ejemplo, tAncFMO1–4 exhibió un comportamiento típico de Michaelis-Menten hacia el sustrato modelo metil-p-tolil sulfuro (eficiencia catalítica (kcat/KM) = 0.98 s−1 mM−1; Fig. 5 complementaria) y una clara selectividad por NADPH como donante de hidruro sobre NADH (Fig. 2b). Se encontró que sus afinidades por O2 (KMO2) estaban en el rango micromolar bajo, lo que implica una capacidad eficiente para usar oxígeno (Fig. 6 complementaria, Tabla 2 complementaria). Además, aunque las enzimas resucitadas podrían consumir NADPH y NADH como donantes de electrones en la reacción de desacoplamiento (Figura 7 complementaria, Tabla complementaria 2), se lograron oxigenaciones significativamente más bajas cuando se usó NADH frente a NADPH (p. ej.: tAncFMO1–4 + NADH = 15 % de conversiones de sustrato, tAncFMO1–4 + NADPH = 100% de conversiones, Fig. 8 complementaria). Esta dependencia de la coenzima está en consonancia con la preponderancia de NADPH en los sistemas de defensa celular antioxidante28 y corrobora que la identidad del cofactor nicotinamida juega un papel fundamental en la definición de la funcionalidad de la enzima. A continuación, se evaluó su comportamiento catalítico utilizando un panel de sustratos prototípicos para evaluar la capacidad de realizar oxidaciones S / N y BV (Fig. 2c; Figs. 9 y 10 complementarias, Tablas complementarias 3 y 4). Observamos que los antepasados ​​de cada linaje tenían las mismas actividades que sus descendientes. Específicamente, tAncFMO1–4 y tAncFMO1–3 realizaron exclusivamente oxidaciones S/N, mientras que tAncFMO5 catalizó la oxidación BV de las tres cetonas probadas con conversión parcial o nula de los sustratos que contenían heteroátomos. Por el contrario, se descubrió que el ancestro previo a la duplicación tAncFMO1–5 oxida los tres tipos de sustratos, siendo activo como enzima oxigenante tanto S/N como BV. Para validar la solidez de la reconstrucción, también se resucitaron antepasados ​​alternativos (Tabla complementaria 5). Todos mostraron el mismo fenotipo que los respectivos tAncFMO (Tabla complementaria 4). Estos hallazgos llevaron a una conclusión crítica: el ancestro de todos los parálogos de FMO de tetrápodos (tAncFMO1–5) era una enzima bifuncional capaz de realizar oxidaciones BV y S/N.

En términos de paisajes de aptitud en el espacio de secuencias, las múltiples actividades catalíticas de tAncFMO1–5 pueden interpretarse como dos picos superpuestos que corresponden a las actividades oxidativas de BV y S/N (Fig. 3a). Mientras que el parálogo hijo, tAncFMO1–4 retuvo un solo pico después de perder la capacidad de realizar oxidaciones BV. Para diseccionar los determinantes de secuencia de las funcionalidades BV frente a S/N, se diseñó una estrategia mutacional revirtiendo algunas de las sustituciones históricas de tAncFMO1–4 para reinstalar la actividad de oxidación de BV. Los modelos estructurales de tAncFMO1–5 y tAncFMO1–4 se construyeron mediante modelos de homología utilizando YASARA29 empleando mAncFMO5 (PDB: 6SEK) como plantilla y AlphaFold230 (Fig. 11 complementaria). Considerando que ocurrieron 45 sustituciones en la rama que conecta a ambos ancestros, identificamos las mutaciones "reversivas" con base en (i) la probabilidad del estado MAP (máximo a posteriori) para el sitio considerado en la reconstrucción, (ii) el grado de conservación en una alineación de secuencias múltiples de FMO oxigenantes de heteroátomos y, (iii) su ubicación estructural. En una primera ronda de análisis, se prepararon mutantes tAncFMO1–4 que albergaban 4, 12 y 16 sustituciones presentes en el sitio activo, en los túneles de sustrato/producto, en la proximidad de FAD y en la primera o segunda capa de residuos alrededor de NADPH (Fig. 3b, Fig. 12 complementaria). Los mutantes 16x y 12x mostraron una actividad baja, pero significativa, para el sustrato de BV, fenilacetona. Sin embargo, el mutante 4x mostró el mismo perfil catalítico que tAncFMO1–4 (Fig. 3c). Por lo tanto, se diseñó otro subconjunto de 4 sustituciones a partir del mutante 12x centrándose en la conservación estricta de los residuos encontrados en el linaje FMO5 y si los aminoácidos dados participaban en interacciones de enlaces de hidrógeno. Este mutante, llamado 4′x, fue capaz de catalizar oxidaciones BV en cantidades bajas, pero aún significativas, mientras mantenía su actividad hacia las oxidaciones S/N. Luego, para diseccionar cuáles de estas sustituciones son necesarias para que tenga lugar la oxidación de BV, se probaron mutantes simples, dobles y triples (Fig. 3d). Se reveló una sinergia positiva entre I60, H275 y H426, ya que cada mutante catalizó exclusivamente oxidaciones S/N, mientras que la oxidación de cetonas solo se restauró cuando se combinaron estas tres sustituciones. Además, la cuarta sustitución (N222) parecía tener un papel perjudicial ya que su inclusión conducía a conversiones más bajas para las oxidaciones de BV. Curiosamente, solo I60 se encuentra dentro del sitio activo. Su cadena lateral hidrofóbica está metida detrás del bolsillo de unión al sustrato, muy cerca de la cara si del anillo de isoaloxazina (Fig. 4). En cambio, H275 y H426 están hacia la periferia de la proteína, a una distancia de 3 a 7 Å de la coenzima NADP+ (Fig. 4b, c). Probablemente, estos dos residuos participan en una red de enlaces de hidrógeno, mediada por moléculas de agua unidas a la superficie, con el dinucleótido en su bolsillo de unión (Fig. 4d, e). A partir de esta percepción estructural, parece claro que la red de interacción responsable de la actividad de oxidación de BV en 3x-tAncFMO1–4 está mediada por interacciones acopladas con los cofactores NADP+ y FAD. Este tipo de interacción ha sido catalogada como epistasis retransmitida por el ligando y se considera la red de sustitución más complicada de establecer para la función enzimática31.

un esquema que representa la estrategia mutacional inversa en términos de funcionalidades como paisajes en el espacio de secuencias23. b Lista de sitios mutados en cada una de las variantes construidas. Las rondas posteriores de mutaciones se representan en escala de grises. c Conversiones catalizadas por mutantes tAncFMO1–4 y d diseccionando 4′×-tAncFMO1–4. Las barras representan los valores medios de conversión y los puntos los valores de cada experimento (n = 2 experimentos independientes). Los datos de origen se proporcionan en la Tabla complementaria 4.

un modelo de tAncFMO1–4 con residuos 4′× (I60T, N222S, H275N, H426N) mostrados en verde. b, c Vistas enfocadas con residuos de 4′× etiquetados. Las distancias entre un H en el Cγ1 de la cadena lateral I60 y el O en el C4 del FAD (2,6 Å) y entre el Nε2 de H275 y el Cε1 de H426 con dos átomos de O del resto fosfato de NADP+ (6,7 y 3,3 Å), respectivamente, se muestran. d Las interacciones de enlaces de hidrógeno para I60 se muestran en azul claro. e Las interacciones de enlaces de hidrógeno para H275 y H426 se describen en azul claro. La estructura secundaria y los residuos de tAncFMO1–5 se muestran en púrpura. Las moléculas FAD y NADP+ se representan en amarillo y azul, respectivamente.

El resultado del análisis mutacional planteó preguntas sobre la base mecánica para la especialización funcional de los FMO tetrápodos. Para abordar esto, primero debemos tomar nota de un rasgo característico de estas enzimas: el papel dual que juega el NADPH. El cofactor primero reduce la flavina y luego sufre un cambio conformacional para colocar su grupo carbamida dentro de la distancia de enlace de hidrógeno del átomo N5 de la flavina. En esta conformación, NADP+ promueve críticamente la formación del (hidro)peróxido de flavina a partir de la reacción de la flavina reducida con el oxígeno molecular. Por lo tanto, NADPH es tanto el donante de electrones como un elemento catalítico integral, esencial para que ocurra la oxigenación del sustrato. Dado este trasfondo mecanicista, primero apuntamos a probar la reactividad de tAncFMO1–5 y tAncFMO1–4 con NADPH. Usando análisis cinéticos rápidos, encontramos que ambas enzimas se reducen por NADPH en condiciones anaeróbicas (kred = 0.0097 ± 1.2 × 10−4 s−1 para tAncFMO1–5 y 0.25 ± 0.016 s−1 para tAncFMO1–4) (Fig. 13). Los FMO reducidos en NADPH anaeróbicamente se emplearon luego para estudiar la reactividad de las enzimas con O2 (0,62 mM). Tanto tAncFMO1–5 como tAncFMO1–4 reaccionaron con oxígeno a velocidades similares (kox = 1,5 ± 0,1 s−1 para tAncFMO1–5 y 3,2 ± 0,11 s−1 para tAncFMO1–4) en un proceso típico de dos pasos en el que el primer paso produjo una especie con propiedades espectrales coincidentes con las propuestas para una C4a- (hidro) peroxiflavina (λmax = 380 nm) 32 (Fig. 5, Fig. 14 complementaria).

Los espectros se registraron oportunamente para monitorear la reacción de tAncFMO1–4 reducido con oxígeno molecular en un aparato de flujo detenido. Se muestran los representativos (n = 3 experimentos independientes). El recuadro superior izquierdo muestra los espectros desconvolucionados ajustados en un proceso de dos pasos \(a\mathop{\to }\limits^{{k}_{1}}b\mathop{\to }\limits^{{k} _ {2}}c\) con k1 = 3,2 ± 0,11 s−1 y k2 = 0,0065 ± 0,0001 s−1. El recuadro superior derecho muestra el cambio de absorbancia entre las especies a (E-FADH2) y b (E-FADOO(H)). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Una cuestión mecanísticamente crucial se refiere al estado de protonación del intermedio reactivo, con la forma protonada atribuida principalmente a la oxidación S/N y la forma desprotonada, en cambio, a la oxidación BV17. El trabajo pionero del grupo de Massey sobre la ciclohexanona monooxigenasa mostró que los espectros del (hidro)peróxido de flavina desprotonado y protonado pueden ser diferentes, ya que la desprotonación conduciría a un desplazamiento hacia el azul del pico de absorción33. Los experimentos de flujo detenido no revelaron ninguna diferencia clara en los espectros intermedios de tAncFMO1–5 y tAncFMO1–4 (Fig. 5, Fig. 14 complementaria). Los cambios inducidos por la protonación en los espectros de flavina-(hidro)peróxido podrían, por lo tanto, ser específicos de la enzima y/o demasiado pequeños para ser medibles en estas enzimas. También puede ser posible que la diversidad funcional entre ambos ancestros surja de otros factores y no solo de la protonación intermedia. Suponiendo un pKa de aproximadamente 8 para el (hidro)peróxido de flavina33,34, la población de enzimas estará parcialmente protonada y parcialmente desprotonada y potencialmente capaz de oxidaciones S/N y BV en nuestras condiciones de ensayo. De hecho, tAncFMO1–5 y tAncFMO5 son capaces de ambas reacciones (Fig. 2c).

El triple mutante T60I, N275H, N426H, que restaura la actividad de BV en tAncFMO1–4, ofrece una pista. La caracterización experimental de esta variante mostró características espectrales y comportamiento cinético similares a tAncFMO1–4 (Figs. 15 y 16 complementarias). Ninguna de estas mutaciones por sí sola es suficiente para instalar la funcionalidad BV que, en cambio, requiere que las tres estén presentes simultáneamente. H275 y H426 introducen sitios cargados positivamente en los residuos de la primera y segunda capa que rodean al NADP+. I60 está físicamente cerca de N61, un residuo esencial y estrictamente conservado que cuelga sobre la flavina N5 y el grupo carbamida cercano del NADP + 35,36 (Fig. 17 complementaria). Por lo tanto, la combinación de estos residuos podría perturbar ligeramente la electrostática que rodea el centro catalítico y afinar la dinámica local del NADP+ catalíticamente esencial y fuertemente ligado. Como resultado, las mutaciones T60I, N275H y N426H podrían permitir la catálisis de BV al favorecer electrostáticamente la formación del intermedio Criegee cargado negativamente y proporcionar al sitio activo la adaptabilidad requerida para la migración del átomo de carbono.

En este trabajo, empleando un enfoque histórico, arrojamos luz sobre el surgimiento y desarrollo de la catálisis en FMO animales. Se diseccionó funcionalmente la trayectoria de la familia FMO en tetrápodos. Como resultado, hay dos aspectos notables a discutir; uno relacionado con la catálisis en enzimas dependientes de nucleótidos y el otro relacionado con la biología de los organismos.

Los FMO son enzimas que catalizan oxigenaciones selectivas mediante la acción orquestada con precisión de varios elementos catalíticos. Durante mucho tiempo se ha sabido que el donante de hidruro (NADPH) juega un papel fundamental, ya que permanece unido durante todo el ciclo catalítico y su liberación a menudo determina la tasa de catálisis33. Sin embargo, se desconoce la base estructural de la influencia del donante de hidruro en el tipo de reacción de oxigenación. Asimismo, las reacciones arquetípicas definidas para la familia FMO son oxidaciones de moléculas que contienen heteroátomos11. El hecho de que se demostrara que el FMO5 humano realiza oxidaciones de BV fue sin duda un cambio de paradigma en la comprensión de esta familia de enzimas14. Al explorar el camino evolutivo de los FMO en vertebrados con mandíbula utilizando como enfoque principal técnicas de reconstrucción de secuencias ancestrales y enzimología, hemos podido comprender estos dos aspectos intrigantes de la catálisis de los FMO. Los FMO llevan a cabo dos químicas fundamentalmente distintas, oxidaciones S/N y BV, a través de interacciones epistáticas entre sustituciones distales en el sitio activo mediadas por los cofactores de nucleótidos FAD y NADP+. Los determinantes de secuencia de estas dos funcionalidades enzimáticas no son mutuamente excluyentes, ya que ambos pueden coexistir en el mismo núcleo proteico, como se demostró para el FMO ancestral multifuncional (tAncFMO1–5). Esto plantea la posibilidad de considerar la actividad de BV como canónica para la familia de proteínas. Queda por determinar hasta que más FMO de otros grupos taxonómicos se caractericen sistemáticamente como FMO de mamíferos8,14,18,19,37,38. Por lo tanto, se pueden esbozar dos conclusiones fundamentales: (i) para las monooxigenasas dependientes de nucleótidos, la funcionalidad es el resultado de interacciones complejas entre las sustituciones funcionales que configuran la red catalítica interna, la identidad del donante de hidruro y el par sustrato/O2 y, ( ii) la especialización enzimática puede ocurrir a través de mutaciones improbables que no se dirigen directamente a los residuos catalíticos sino que alteran el delicado equilibrio de las interacciones y la dinámica estructural de la enzima.

Con respecto al aspecto de la biología de los organismos, nuestro análisis ha revelado que todos los FMO tetrápodos existentes evolucionaron a partir de una enzima ancestral que llevó a cabo monooxigenaciones tanto de BV como de heteroátomos. Este hallazgo implica entonces que la actividad de BV puede haber sido crucial para la supervivencia en el pasado y que no es el resultado de un evento de neofuncionalización. La divergencia funcional observada en los parálogos FMO modernos es el resultado de un proceso de optimización funcional a través de la duplicación de genes, en línea con el modelo de innovación-amplificación-divergencia (IAD)39. Después del primer evento de duplicación, el linaje FMO5 conservó la función enzimática del ancestro previo a la duplicación y la actividad de oxidación de BV perdura en las especies modernas14. El linaje FMO1–4 está optimizado funcionalmente hacia la oxigenación de moléculas que contienen heteroátomos y se especializa mediante duplicaciones sucesivas de genes. Nuestra hipótesis es que la transición de vertebrados óseos a tetrápodos implicó desafíos ambientales40 (dieta, coexistencia con plantas terrestres, exposición a una mayor concentración de O2, etc.) que desencadenaron la expansión y diversificación de la familia de FMO. Una idea similar se especuló vagamente en el pasado, reflejando la propuesta para los CYP41, ya que los FMO son capaces de transformar los metabolitos de las plantas en sustancias menos tóxicas42. Esta hipótesis está respaldada por la presencia de una sola copia de FMO en peces óseos. Los FMO crecieron en número y se volvieron funcionalmente diversos con el tiempo, otorgando a los tetrápodos un sistema de desintoxicación altamente versátil, capaz de convertir compuestos que contienen heteroátomos y carbonilo.

La filogenia FMO de los tetrápodos se construyó empleando como fuente nuestro conjunto de datos previamente informado18. El conjunto de datos se reforzó de la siguiente manera: (i) Se emplearon secuencias de FMO de Homo sapiens previamente caracterizadas experimentalmente como consultas en búsquedas BLASTp en secuencias de proteínas no redundantes GenBank (nr) y en Uniprot KB. Las búsquedas se restringieron por la taxonomía de organismos por clases u órdenes con el objetivo de extraer toda la diversidad de FMO incluidas en los vertebrados terrestres (es decir: clases de Amphibia, Aves, Crocodylia, Lepidosauria y Mammalia y orden de Testudines) guiadas por la base de datos de conocimiento TimeTree43. También se extrajeron grupos de peces óseos, como Actinopterygii, Cladistia y Chondrichthyes, para recolectar secuencias para la raíz. (ii) Se excluyeron las secuencias parciales o de baja calidad (según la definición del NCBI44). (iii) Todas las secuencias recopiladas se recopilaron y analizaron en una alineación de secuencia múltiple (MSA) utilizando MAFFT v745, eliminando aquellas que se recopilaron más de una vez. Las secuencias correspondientes a ORF verdaderos se mantuvieron en el conjunto de datos (cuando fue necesario, esto se confirmó mediante búsquedas tBLASTn recíprocas). Este proceso aseguró la construcción de un conjunto de datos representativo y no redundante. Esto incluyó 35, 272, 77, 55, 31 y 66 homólogos de FMO de anfibios, mamíferos, aves, reptiles, testudinos y peces óseos, respectivamente. El MSA contenía 536 secuencias (613 sitios) y se recortó manualmente para extensiones de secuencia única (537 sitios) (Datos complementarios 1). Los parámetros del modelo de mejor ajuste (matriz de sustitución JTT y α = 1,114) se obtuvieron mediante el criterio de información de Akaike en ProtTest v3.446. La filogenia se infirió por el método de máxima verosimilitud en RAxML v8.2.10 (módulo HPC-PTHREADS)47. La robustez de la topología se evaluó ejecutando 500 bootstraps no paramétricos y luego se sometieron a la expectativa de bootstrap de transferencia (TBE) en BOOSTER48. También se infirió la filogenia en Mr. Bayes v3.2.649 ejecutando 2,000,000 de generaciones hasta que se alcanzó una convergencia <0.2 (determinada por la desviación estándar de las frecuencias divididas). Se empleó Figtree v1.4.2 para visualizar y editar los árboles. La reconstrucción de la secuencia ancestral se realizó en PAMLX v.4.9 como reconstrucción marginal utilizando el módulo CODEML50. Las secuencias se analizaron utilizando una matriz de sustitución empírica, una frecuencia de aminoácidos de equilibrio empírico (modelo = 3), 4 categorías gamma (α = 1,114) y una matriz de sustitución de Jones. La distribución de probabilidad posterior de los estados ancestrales en cada sitio se analizó en los nodos correspondientes a tAncFMO1–5, tAncFMO5, tAncFMO1–4 y tAncFMO1–3. La longitud de los ancestros fue tratada por parsimonia analizando la presencia/ausencia de brechas en los nodos objetivo sobre la base de la longitud de las secuencias derivadas en cada clado (algoritmo de Fitch)26. Los sitios se consideraron ambiguamente reconstruidos cuando los estados alternativos mostraban probabilidades posteriores (PP) > 0,2. Las secuencias de los ancestros alternativos (Alt_tAncFMOs) se generaron al incluir en conjunto los segundos mejores estados para los sitios reconstruidos de manera ambigua más los estados MAP (PP> 0.8).

El diseño de mutantes se basó en un análisis bioinformático que incluye tres componentes principales: (i) la precisión de la reconstrucción por sitio, (ii) el grado de conservación de cada sitio y (iii) el entorno estructural de cada sitio. Primero, las 45 sustituciones en la rama que conecta tAncFMO1–5 con tAncFMO1–4 se enumeraron y se inspeccionaron para determinar su PP en la reconstrucción. Aquellos que mostraban PP > 0,8 en ambos nodos fueron seleccionados para el siguiente paso, ya que se consideraron verdaderas sustituciones. Además, cuando en uno de los nodos el sitio inspeccionado se reconstruía con un PP < 0,8 y el estado alternativo (PP > 0,2) era diferente al estado MAP en el otro nodo, se incluía en la selección. Este primer proceso nos permitió reducir el número de sustituciones a inspeccionar a 27. Posteriormente, se analizó el grado de conservación de cada uno de los sitios seleccionados empleando el servidor ConSurf51. Los sitios identificados como conservados en todo el conjunto de datos o solo entre el linaje oxidativo de heteroátomos o el linaje BV se seleccionaron adicionalmente. Finalmente, se inspeccionó el entorno estructural de cada uno de los sitios utilizando las estructuras de mAncFMO5 (PDB 6SEK) como modelo para el linaje BV y mAncFMO2 (PDB 6SF0) como modelo para el linaje oxidante de heteroátomos. Dieciséis sitios fueron detectados como candidatos para probar experimentalmente. Estos sitios se dividieron en tres subgrupos según su proximidad al sitio activo y/o grado de conservación. Así, 4× incluía 4 sustituciones en el sitio activo, 12× incluía las sustituciones de 4× más 8 sitios y 16× incluía todos los sitios seleccionados.

La estructura tridimensional de tAncFMO1–5 y tAncFMO1–4 se modeló utilizando AlphaFold230 con la configuración casp14/full_dbs. Además, se obtuvieron modelos estructurales utilizando YASARA29 y 6SEK como plantilla. Estos contenían los cofactores FAD y NADPH en el sitio activo. Las estructuras se inspeccionaron con ChimeraX 1.2.5 y PyMOL 2.5.2. para racionalizar mutaciones que podrían ser beneficiosas para introducir la oxidación de Baeyer-Villiger. Los residuos se clasificaron en tres grupos dependiendo de si estaban presentes en los dominios de unión a FAD y NADPH, o en la inserción de 80 residuos que previamente se demostró que era fundamental para la formación de túneles de sustrato. Una vez categorizados, los residuos se asignaron como 'superficie' o 'núcleo' (Fig. 12 complementaria). Este paso ayudó a eliminar rápidamente los residuos que probablemente no desempeñaron ningún papel en la alteración de la función. Todos los residuos restantes se mantuvieron y evaluaron usando la estrategia de mutación inversa mencionada anteriormente.

Las células NEB10β de Escherichia coli (n.º de cat. C3019I), DpnI (n.º de cat. R0176L) y BsaI-HF V2 (n.º de cat. R3733S) eran de New England Biolabs. La ligasa de ADN T4 (Cat. # EL0013) se solicitó a Thermo Fisher Scientific. NADPH (Cat. # 44335000) se ordenó a Oriental Yeast Co. El N-óxido de tamoxifeno (Cat. # FT27997) y el N-óxido de bencidamina (Cat. # FB18263) se compraron a Biosynth y todos los demás productos químicos fueron de Sigma-Aldrich.

Los genes sintéticos que contenían sitios de restricción BsaI en los extremos 5′ y 3′ se solicitaron a Twist Bioscience o a Integrated DNA Technology (IDT) para los tAncFMO: 1–3, 1–4, 1–5, 5 y 4×. , 4×′, 12× y 16× variantes, respectivamente. Los genes liofilizados se resuspendieron hasta una concentración final de 10 ng µl−1 en Tris-HCl 10 mM estéril, pH 8,0. Todos los genes tAncFMO se clonaron siguiendo el método de clonación Golden Gate. El vector receptor era un plásmido pBAD modificado de tal manera que la proteína diana se expresa fusionada en su extremo N-terminal con una proteína N-6xHis-tag-SUMO. La mezcla de clonación fue la siguiente: 55,4 ng de inserto tAncFMOs, 75 ng de vector de entrada Golden Gate (una relación molar de 2:1 inserto: vector), 15 U de BsaI-HF V2, 15 U de ADN ligasa T4, tampón de ADN ligasa T4 (1x) y se añadió agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 20 μl. Se preparó un control negativo sin ningún inserto y los ciclos de PCR fueron los siguientes: el primer paso con un ciclo a 37 °C por 1 h fue seguido por 55 °C por 10 min. Luego se fijó la temperatura a 65 °C durante 20 min y se mantuvo a 8 °C. Una vez clonados, los plásmidos pBAD-6xHis-SUMO-tAncFMO se transformaron en células E. coli NEB10β competentes con CaCl2. Se añadieron 5,0 μl de ADN de plásmido a 100 μl de células competentes de CaCl2 y se incubaron durante 30 min. A continuación, las células se sometieron a un choque térmico a 42 °C durante 30 s y se incubaron en hielo durante 5 min. Se agregaron 500 μl de LB-SOC para permitir que las células se recuperaran a 37 °C durante 1 h. El sedimento de células resuspendidas se sembró luego en agar LB que contenía 100 μg ml−1 de ampicilina y se incubó durante la noche a 37 °C. Los plásmidos se purificaron y verificaron mediante secuenciación. Las reservas de glicerol al veinte por ciento se almacenaron a -70 °C.

Se cultivó un preinóculo de 4 ml de LB-amp (50 μg ml-1) durante la noche a 37 °C y se usó para inocular matraces con deflectores de 2 l que contenían 400 ml de medio Terrific-Broth, suplementado con 50 mg l-1 de ampicilina y incubado a 37 °C. La expresión se indujo mediante la adición de L-arabinosa al 0,02 % de un stock al 20 % estéril (p/v) cuando la DO600 estaba entre 0,2 y 0,5. Los cultivos se cultivaron a 24 °C con agitación durante un total de 30 h antes de la recolección. Las células se recogieron por centrifugación (2755 g, 25 min). Los sedimentos se resuspendieron en tampón A (NaCl 250 mM, fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5) con una proporción de 5:1 [volumen (ml): masa (g)] y se complementaron con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,10 mM y β- mercaptoetanol. La disrupción celular se realizó mediante sonicación (70 % de amplitud, 5 s encendido, 5 s apagado, durante un total de 20 min). Después de centrifugar a 19.500 g durante 20 min, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en Tampón A2 (NaCl 250 mM, fosfato de potasio 50 mM, TritonTm X-100 reducido al 0,5 %, pH 7,5) (TritonTm X-100 reducido, Cat . # X100RS-25G, Sigma-Aldrich) en la misma proporción que antes (5:1). El sedimento resuspendido se mezcló durante la noche a 4 °C para solubilizar las proteínas de membrana y se centrifugó a 19 500 g para recolectar el sobrenadante. Los tAncFMO se purificaron con una resina de cromatografía de afinidad de iones metálicos (Cat. # 17-5318-02, Cytiva). El extracto libre de células se aplicó a la columna y se lavó con concentraciones crecientes de imidazol. El tampón B contenía (NaCl 250 mM, fosfato potásico 50 mM, imidazol 300 mM, TritonTm X-100 al 0,5% reducido, pH 7,5). Después de los pasos de lavado con imidazol 0, 25 y 50 mM, la proteína finalmente se eluyó con imidazol 300 mM. El tampón de elución se intercambió con un tampón de almacenamiento (NaCl 250 mM, fosfato de potasio 50 mM, reducción de TritonTm X-100 al 0,05 %, pH 7,5) utilizando una columna de desalinización HiPrep 26/10 (n.° de catálogo 17-0851-01, Cytiva) .

Las enzimas marcadas con 6xHis-SUMO purificadas se congelaron con nitrógeno líquido y se mantuvieron a -70 °C. Los experimentos se realizaron utilizando estas alícuotas. Las concentraciones de tAncFMO se determinaron a partir de muestras congeladas que se descongelaron a temperatura ambiente y luego se incubaron a 95 °C, se centrifugaron y el sobrenadante se analizó en un espectrofotómetro Jasco V-660. Utilizando εFAD = 11,3 mM−1 cm−1 a 450 nm, se cuantificó la cantidad de holoenzima y se consideró igual para las otras alícuotas respectivas.

Para la mutagénesis dirigida al sitio, se preparó una mezcla de reacción de PCR con cebador 10 µM, directo e inverso, 100 ng de ADN molde, DMSO al 1,6 %, MgCl2 0,8 mM y 1 × Pfu Ultra II Hotstart Master Mix (n.º de cat. 600850, Agilent). El ciclo Quick Change PCR se realizó con el siguiente método: primero una incubación de 5 min a 95 °C, luego los ciclos (95 °C durante 5 min, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 6 min) se repitieron 25 veces ; seguido de 72 °C por 10 min y finalizando con 8 °C en espera. La mezcla de PCR se digirió con DpnI durante la noche y se transformó en células competentes de E. coli CaCl2. Las mutaciones posteriores se realizaron utilizando los mutantes obtenidos previamente. Se emplearon los siguientes cebadores: T60I Fw 5′-GCGCGCATCAATCTATAAAAGTGTAATTATAAACACGAGCAAAGAG-3′

& Rv 5′-CTCTTTGCTCGTGTTTATAATTACACTTTTATAGATTGATGCGCGC-3′;

N222S Fw 5′-GGGAAGCTGGGTCCTGAATCGGGTATCG-3′ y

Rv 5′-CGATACCCGATTCAGGACCCAGCTTCCC-3′;

N275H Fw 5′-CTACGGATTAGTGCCTCAACATAGAATCCTTTCCCAACA-3′

& Rv 5′-TGTTGGGAAAGGATTCTATGTTGAGGCACTAATCCGTAG-3′;

N462H Fw 5′-GGTTTGTTACGAGTCAGCGTCATACCATTCAAACGGATTAT-3′ y

Rv 5′-ATAATCCGTTTGAATGGTATGACGCTGACTCGTAACAAACC-3′

Para evaluar la actividad de oxidación del S, se probaron los tioéteres aromáticos metil-p-tolil sulfuro sulfuro (N.° de catálogo 275956-5G, Sigma-Aldrich) y el voluminoso sulfuro de bencilfenilo (N.° de catálogo 8415660025, Sigma-Aldrich)52,53. Para la actividad de oxidación de N, se seleccionaron bencidamina (Cat. # B5524-5G, Sigma-Aldrich) y tamoxifeno (Cat. # T5648-1G, Sigma-Aldrich)54,55. Para seguir la actividad de BV, la hepta-2-ona alifática (n.° de cat. 537683-100 ML, Sigma-Aldrich), la ciclohexanona alicíclica (n.° de cat. 29140-100 ML, Sigma-Aldrich) y la fenilacetona aromática (n.° de cat. 135380-100G, Sigma-Aldrich) fueron seleccionados56,57.

Las conversiones de sustrato se realizaron por duplicado, utilizando sustrato 1,0–5,0 mM (metanol al 1 %), NADPH 0,10 mM, enzima 2,0 µM, fosfito deshidrogenasa (PTDH, producido internamente) 5,0 µM y fosfito de sodio 20 mM. Los dos últimos componentes se utilizaron como sistema de regeneración para NADPH y el control no contenía tAncFMO. Todos los compuestos se prepararon en tampón de almacenamiento (50 mM KPi, 250 mM NaCl, 0,05 % TritonTm X-100 reducido, pH 7,5), el volumen de reacción final se ajustó a 1,0 ml y se puso en viales de 4 ml antes de incubarlos a 30 °C. con agitación, durante 16 h. Las conversiones de fenilacetona, heptan-2-ona, ciclohexanona, sulfuro de bencil fenilo y sulfuro de metil-p-tolilo se analizaron mediante GC-MS, mientras que las conversiones de bencidamina y tamoxifeno se controlaron mediante HPLC. Debido a su escasa solubilidad, las conversiones de tamoxifeno, bencidamina y sulfuro de bencilfenilo se realizaron utilizando sustrato 1,0 mM mientras que los sustratos restantes se ensayaron a 5,0 mM.

Para el análisis GC-MS, los compuestos se extrajeron añadiendo un volumen de acetato de etilo con 0,02 % (v/v) de mesitileno como patrón interno. Las muestras se agitaron durante 20 s, se centrifugaron y la fase orgánica se eluyó con sulfato de magnesio anhidro. Los análisis de GC-MS se realizaron en un aparato GCMS-QP2010 Ultra (SHIMADZU) utilizando una columna Agilent HP-1 y HP-5 ms (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). El método fue el siguiente: temperatura del inyector y del detector a 250 °C, un split ratio de 5,0 y un volumen de inyección de 1 μl. La temperatura de la columna se mantuvo a 50 °C durante 4 min, se aumentó 10 °C/min hasta 250 °C y se mantuvo durante 5 min. Los tiempos de retención de los sustratos y productos se muestran en la información complementaria (Tabla S3) con los espectros de masas correspondientes. Las conversiones se calcularon en base al agotamiento del sustrato y se normalizaron con el patrón interno.

Los análisis de HPLC se realizaron después de diluir 300 μl de la muestra en 1200 μl de acetonitrilo, agitar en vórtex durante 20 s y centrifugar. El análisis del sobrenadante se realizó mediante HPLC de fase inversa. Las muestras se inyectaron con un volumen de 10 μl en un sistema de HPLC JASCO AS2051 Plus, equipado con una columna Grace Alltima HP C18 (5 μm, 4,6 × 250 mm). Los disolventes utilizados fueron agua con ácido fórmico al 0,1% v/v (A) y acetonitrilo (B) y el caudal fue de 0,8 ml.min-1. Para la bencidamina el método correspondió a 8 min en un flujo isocrático de 35% B y 65% ​​A. La bencidamina y el N-óxido de bencidamina se detectaron a 308 nm con un tiempo de retención de 5,3 min y 5,7 min, respectivamente. Para el tamoxifeno el método fue el siguiente: 30 min en un gradiente de 40–95 % B, 3 min con 95 % B seguido de 5 min de gradiente disminuido de 95–40 % B y finalmente un reequilibrio de 2 min. El tamoxifeno y el N-óxido de tamoxifeno se detectaron a 276 nm con un tiempo de retención de 10,5 min y 11,7 min, respectivamente. La identidad de ambos productos se confirmó utilizando los estándares correspondientes y la conversión se calculó en función del agotamiento del sustrato.

Para observar la formación de C4a-(hidro)peroxiflavina, llevamos a cabo experimentos de flujo detenido utilizando el espectrómetro de flujo detenido SX20 equipado con el detector de matriz de fotodiodos o el módulo de tubos fotomultiplicadores (PMT) (Fotofísica aplicada, Surrey, Reino Unido) . Los resultados se obtuvieron mezclando 50 μl de dos soluciones en modo de mezcla simple. Todas las soluciones se prepararon en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 250 mM y TritonTm X-100 al 0,05 % reducido, pH 7,5 a 25 °C. Para cada reacción, se utilizó una concentración de enzima de 8 a 15 μM y las mediciones se realizaron por triplicado técnico. Cuando fue necesario, las soluciones se complementaron con glucosa 5,0 mM. Las soluciones enzimáticas se hicieron anaeróbicas lavando las soluciones durante 10 min con nitrógeno, seguido de la adición de glucosa oxidasa 0,3 μM (Aspergillus niger, tipo VII, Cat. # G2133-50KU, Sigma-Aldrich) para consumir el oxígeno sobrante. Para reducir el cofactor de flavina en los tAncFMO, se agregaron 1 a 1,2 equivalentes de NADPH a la solución enzimática. La solución resultante se incubó en hielo hasta que se completó el blanqueo de FAD, lo que indica una reducción completa a FADH2. Para determinar las tasas de formación del intermedio, las enzimas reducidas se mezclaron con tampones que contenían diferentes concentraciones de dioxígeno. Las concentraciones finales de dioxígeno (0,13, 0,31, 0,61, 0,96 mM después de mezclar) se lograron mezclando la solución enzimática anaeróbica con (1) tampón saturado con aire; (2) volúmenes iguales de tampón de argón al 100 % y tampón de O2 al 100 %; (3) tampón de O2 al 100 %; (4) Tampón de O2 al 100 % en hielo. Todas las soluciones se burbujearon durante 10 min a temperatura ambiente, excepto la última que se hizo en hielo. Las tasas observadas (kobs) se determinaron ajustando trazas a funciones exponenciales. Todos los datos se analizaron con el software Pro-Data Viewer v4.2.12, Pro-Kineticist v1.0.13 (Applied Photophysics, Surrey, Reino Unido) y GraphPad Prism 6.05 (La Jolla, CA, EE. UU.).

Los ensayos de cinética en estado estacionario se realizaron por triplicado técnico en un espectrofotómetro Jasco V-660. La actividad enzimática de las proteínas ancestrales se midió monitorizando el consumo de NADPH (absorbancia a 340 nm, ε340 = 6,22 mM−1 cm−1 para NADPH). El tampón utilizado para los análisis cinéticos fue fosfato de potasio 50 mM, NaCl 250 mM, Triton™ X-100 reducido al 0,05%, pH 7,5. El espectrofotómetro se fijó a 25 °C y la reacción se inició añadiendo la enzima. Para la determinación de la KM de los sustratos se utilizó NAD(P)H 100 μM. Las tasas de desacoplamiento de NAD(P)H se determinaron en ausencia de sustratos por duplicado.

La afinidad por el oxígeno se determinó empleando el sistema de electrodos de oxígeno The Oxygraph+ (Hansatech Instruments Ltd., Reino Unido). El consumo de oxígeno se controló después de que las enzimas (concentración que oscila entre 3 y 12 μM) se mezclaron con un tampón saturado de aire que contenía el cofactor NADPH y un sustrato. Todas las mediciones se realizaron por duplicado. A temperatura ambiente, el agua saturada de aire contiene alrededor de 0,2 mM de oxígeno. Por lo tanto, se agregó un exceso de cofactor de NADPH (0,6 mM) y sustrato (sulfuro de metil-p-tolilo o fenilacetona, 2,5 mM) en la mezcla de reacción para garantizar que la concentración de oxígeno sea el único factor que afecte los valores de kobs. Cuando el oxígeno se agotó por completo, la medición había terminado. Los valores de kobs se calcularon mediante el software OxyTrace+ Windows® (Hansatech Instruments Ltd., Reino Unido).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las secuencias ancestrales (tAncFMO) generadas en este estudio se han depositado en la base de datos Genbank con los códigos de acceso: OP381052 (tAncFMO1–5), OP381053 (tAncFMO5), OP381054 (tAncFMO1–4) y OP381055 (tAncFMO1–3). Los datos experimentales generados en este estudio se proporcionan en el archivo de información complementaria/datos de origen. El conjunto de datos recopilados para el análisis filogenético se proporciona en la Información complementaria. Las relaciones taxonómicas y los datos de la escala de tiempo evolutiva utilizados en este estudio están disponibles en la base de conocimientos de TimeTree 5 [http://www.timetree.org/]. Las imágenes de la silueta de los organismos utilizados en este estudio están disponibles en la base de datos PhyloPic [http://www.phylopic.org/]. Los datos estructurales utilizados en este estudio están disponibles en la base de datos PDB bajo los códigos de acceso: 6SEK (mAncFMO5) y 6SF0 (mAncFMO2). Los datos de secuencia utilizados en este estudio están disponibles en la base de datos Genbank con los códigos de acceso: OP381050 (mAncFMO1), OP381047 (mAncFMO2), OP381048 (mAncFMO3–6) y OP381049 (mAncFMO5). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos al Dr. Hein Wijma por proporcionar los modelos AlphaFold y realizar los experimentos de acoplamiento. Agradecemos al Dr. Walter Lapadula por las discusiones sobre la historia evolutiva de las FMO. Este trabajo fue financiado por: el programa de Investigación e Innovación Horizon 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No. 847675 COFUND project oLife (MLM), el programa de Investigación e Innovación Horizon 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie No. 722390 (GB) y Fondazione Cariplo No. 2020-0894 (AM y MWF).

Estos autores contribuyeron igualmente: Gautier Bailleul, Guang Yang.

Grupo de Enzimología Molecular, Universidad de Groningen, Groningen, Países Bajos

Gautier Bailleul, Guang Yang, Marco W. Fraaije y Maria Laura Mascotti

Departamento de Biología y Biotecnología "Lazzaro Spallanzani", Universidad de Pavía, Pavía, Italia

Callum R. Nicoll y Andrea Mattevi

IMIBIO-SL CONICET, Facultad de Química Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, San Luis, Argentina

María Laura Mascotti

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Todos los autores enumerados realizaron experimentos y/o analizaron datos. GB y CRN establecieron los protocolos de purificación y expresión, realizaron el análisis evolutivo y la reconstrucción de secuencias ancestrales bajo la guía de MLM. GB realizó todos los experimentos de clonación, mutagénesis y conversión. GB y GY produjeron las enzimas y realizaron la cinética de estado estacionario. GY realizó los experimentos de afinidad de oxígeno y flujo detenido. CRN generó los modelos estructurales y realizó el análisis mecánico estructural. GY, GB, CRN y MLM prepararon las cifras. MLM escribió el artículo y CRN, AM y MWF lo editaron. Todos los autores brindaron comentarios críticos y ayudaron a dar forma a la investigación, el análisis y el artículo. MLM concibió la idea original con el apoyo de AM y MWF.

Correspondencia a María Laura Mascotti.

Todos los autores declaran no tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Bailleul, G., Yang, G., Nicoll, CR et al. Evolución de la funcionalidad enzimática en las monooxigenasas que contienen flavina. Nat Comun 14, 1042 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36756-x

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Recibido: 14 Septiembre 2022

Aceptado: 15 febrero 2023

Publicado: 24 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36756-x

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