Noticias

May 06, 2023

Señalización antiviral por una proteasa CRISPR activada por nucleótidos cíclicos

Naturaleza volumen 614, páginas

Nature, volumen 614, páginas 168–174 (2023)Citar este artículo

10k Accesos

1 Citas

167 Altmetric

Detalles de métricas

Los sistemas de defensa CRISPR, como el conocido Cas9 dirigido al ADN y los sistemas de tipo III dirigidos al ARN, están muy extendidos en los procariotas1,2. Este último orquesta una respuesta antiviral compleja que se inicia a través de la síntesis de oligoadenilatos cíclicos después del reconocimiento de ARN extraño3,4,5. Entre el gran conjunto de proteínas que están vinculadas a los sistemas de tipo III y que se prevé que se unen a los oligoadenilatos cíclicos6,7, nos llamó la atención una proteasa Lon asociada a CRISPR (CalpL). CalpL contiene un dominio sensor de la familia SAVED7 fusionado con un dominio efector de proteasa Lon. Sin embargo, se desconoce el modo de acción de este efector. Aquí informamos la estructura y función de CalpL y mostramos que esta proteína soluble forma un complejo tripartito estable con otras dos proteínas, CalpT y CalpS, que están codificadas en el mismo operón. Después de la activación por tetraadenilato cíclico (cA4), CalpL oligomeriza y escinde específicamente el homólogo de MazF CalpT, que libera el factor σ CalpS de función extracitoplasmática del complejo. Nuestros datos proporcionan una conexión directa entre la detección basada en CRISPR de ácidos nucleicos extraños y la regulación transcripcional. Además, la presencia de un dominio SAVED que se une al tetraadenilato cíclico en un efector CRISPR revela un vínculo con el sistema de señalización de antifagos basado en oligonucleótidos cíclicos.

Esta es una vista previa del contenido de suscripción, acceda a través de su institución

Acceda a Nature y a otras 54 revistas de Nature Portfolio

Obtenga Nature+, nuestra suscripción de acceso en línea de mejor valor

$29.99 / 30 días

cancelar en cualquier momento

Suscríbete a este diario

Reciba 51 ediciones impresas y acceso en línea

$199.00 por año

solo $ 3.90 por número

Alquila o compra este artículo

Obtenga solo este artículo durante el tiempo que lo necesite

$39.95

Los precios pueden estar sujetos a impuestos locales que se calculan durante el pago

Las estructuras cristalinas se han depositado en la base de datos del Protein Data Bank con los códigos de acceso 7QDA, 8B0R y 8B0U. Los datos y modelos SAXS se han depositado en el Banco de datos biológicos de dispersión de ángulo pequeño con los códigos de acceso SASDQM4, SASDQN4, SASDQP4 y SASDQQ4. En este estudio se utilizaron las siguientes entradas del banco de datos de proteínas: 2H27, 3K1J, 4ME7, 4IZJ, 4LUP, 5ZX2, 5CR2, 6VM6, 6SCE y 7RWK. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

No se utilizó ningún código personalizado en este trabajo.

Makarova, KS, Wolf, YI & Koonin, EV Clasificación y nomenclatura de los sistemas CRISPR-Cas: de dónde a partir de aquí. CRISPR J. 1, 325–336 (2018).

Artículo Google Académico

Zhu , Y. , Klompe , SE , Vlot , M. , van der Oost , J. & Staals , RHJ Disparando a los mensajeros: sistemas CRISPR-Cas dirigidos al ARN . Biosci. Reps. 38, BSR20170788 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Kazlauskiene, M., Kostiuk, G., Venclovas, Č., Tamulaitis, G. y Siksnys, V. Una vía de señalización de oligonucleótidos cíclicos en los sistemas CRISPR-Cas de tipo III. Ciencia 357, 605–609 (2017).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Niewoehner, O. et al. Los sistemas CRISPR-Cas de tipo III producen segundos mensajeros de oligoadenilatos cíclicos. Naturaleza 548, 543–548 (2017).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Rouillon, C., Athukoralage, JS, Graham, S., Grüschow, S. & White, MF Control de la síntesis de oligoadenilatos cíclicos en un sistema CRISPR de tipo III. eLife 7, e36734 (2018).

Artículo Google Académico

Shmakov, SA, Makarova, KS, Wolf, YI, Severinov, KV y Koonin, EV Predicción sistemática de genes vinculados funcionalmente a sistemas CRISPR-Cas mediante análisis de vecindad de genes. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 115, E5307–E5316 (2018).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Shah, SA et al. La búsqueda exhaustiva de proteínas accesorias codificadas con casetes de genes CRISPR-cas tipo III de arqueas y bacterias revela 39 nuevas familias de genes cas. ARN Biol. 16, 530–542 (2019).

Artículo Google Académico

Gasiunas, G., Sinkunas, T. & Siksnys, V. Mecanismos moleculares de la inmunidad microbiana mediada por CRISPR. Celúla. mol. Ciencias de la vida 71, 449–465 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Sasnauskas, G. & Siksnys, V. Adaptación CRISPR desde una perspectiva estructural. actual Opinión Estructura. Biol. 65, 17–25 (2020).

Artículo Google Académico

Jiang, F. & Doudna, JA Estructuras y mecanismos CRISPR–Cas9. año Rev. Biophys. 46, 505–529 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Jinek, M. et al. Una endonucleasa de ADN guiada por ARN dual programable en inmunidad bacteriana adaptativa. Ciencia 337, 816–821 (2012).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Athukoralage, JS & White, MF Señalización y regulación de oligoadenilatos cíclicos por nucleasas en anillo durante la defensa CRISPR tipo III. ARN 27, 855–867 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Jia, N., Jones, R., Sukenick, G. & Patel, DJ Formación de cA4 del segundo mensajero dentro del bolsillo compuesto Csm1 Palm del complejo tipo III-A CRISPR-Cas Csm y su ruta de liberación. mol. Celda 75, 933–943.e6 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Makarova, KS, Anantharaman, V., Grishin, NV, Koonin, EV y Aravind, L. CARF y dominios WYL: reguladores de unión a ligandos de los sistemas de defensa procarióticos. Frente. Gineta. 5, 102 (2014).

Artículo Google Académico

Lau, RK et al. Estructura y mecanismo de una endonucleasa bacteriana activada por trinucleótidos cíclicos que media la inmunidad bacteriófaga. mol. Celda 77, 723–733.e6 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Lintner, NG et al. La estructura de la proteína Csa3 asociada a CRISPR proporciona información sobre la regulación del sistema CRISPR/Cas. J. Mol. Biol. 405, 939–955 (2011).

Artículo CAS Google Académico

McMahon, SA et al. Estructura y mecanismo de una ADN nucleasa de defensa CRISPR tipo III activada por oligoadenilato cíclico. Nat. común 11, 500 (2020).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Rostøl, JT et al. La nucleasa Card1 proporciona defensa durante la inmunidad CRISPR tipo III. Naturaleza 590, 624–629 (2021).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

García-Doval, C. et al. Mecanismos de activación y autoinactivación de la ribonucleasa CRISPR dependiente de oligoadenilato cíclico Csm6. Nat. común 11, 1596 (2020).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Lawrence, CM, Charbonneau, A. y Gauvin, C. El tetraadenilato cíclico (cA4) activa el factor de transcripción Csa3 asociado a CRISPR, proporcionando activación de retroalimentación de la adquisición de protospacer y la expresión de crRNA. FASEB J. 34, 1–1 (2020).

Google Académico

Meeske, AJ, Nakandakari-Higa, S. & Marraffini, LA La latencia celular inducida por Cas13 previene el aumento de bacteriófagos resistentes a CRISPR. Naturaleza 570, 241–245 (2019).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Burroughs, AM, Zhang, D., Schäffer, DE, Iyer, LM y Aravind, L. Los análisis genómicos comparativos revelan una vasta red novedosa de sistemas centrados en nucleótidos en conflictos biológicos, inmunidad y señalización. Ácidos Nucleicos Res. 43, 10633–10654 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Lowey, B. et al. La inmunidad CBASS utiliza efectores relacionados con CARF para detectar señales de oligonucleótidos cíclicos enlazados en 3′-5′ y 2′-5′ y proteger a las bacterias de la infección por fagos. Celda 182, 38–49.e17 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Makarova, KS y col. Clasificación evolutiva y funcional de la superfamilia de dominios CARF, sensores clave en la defensa antivirus de procariotas. Ácidos Nucleicos Res. 48, 8828–8847 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Zwart, PH et al. Solución de estructura automatizada con la suite PHENIX. Métodos Mol. Biol. 426, 419–435 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Chen, VB et al. MolProbity: validación de estructuras de todos los átomos para cristalografía macromolecular. Acta Crystallogr. D 66, 12–21 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Chung, IY & Paetzel, M. Estructuras cristalinas de la proteasa VP4 del virus de la ascitis de cola amarilla: atrapar un complejo trans acil-enzima del sitio de escisión interna en un sitio activo nativo de la díada Ser / Lys. J. Biol. química 288, 13068–13081 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. & Sonnhammer, ELL Predicción de la topología de proteínas transmembrana con un modelo oculto de Markov: aplicación a genomas completos. J. Mol. Biol. 305, 567–580 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Fatma, S., Chakravarti, A., Zeng, X. y Huang, RH Mecanismos moleculares del sistema de defensa antifago CdnG-Cap5 que emplea 3′, 2′-cGAMP como segundo mensajero. Nat. común 12, 6381 (2021).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Jiang, K. et al. Base estructural de la formación del complejo CAMSAP-katanina regulador del extremo negativo de los microtúbulos. Estructura 26, 375–382.e4 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Saha, CK, Sanches Pires, R., Brolin, H., Delannoy, M. & Atkinson, GC FlaGs y webFlaGs: descubrimiento de biología novedosa a través del análisis de la conservación de la vecindad de genes. Bioinformática 37, 1312–1314 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Zimmermann, L. et al. Un kit de herramientas de bioinformática MPI completamente reimplementado con un nuevo servidor HHpred en su núcleo. J. Mol. Biol. 430, 2237–2243 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Jumper, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Holm, L. & Rosenström, P. Servidor Dali: mapeo de conservación en 3D. Ácidos Nucleicos Res. 38, W545–W549 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Simanshu, DK, Yamaguchi, Y., Park, J.-H., Inouye, M. & Patel, DJ Base estructural del reconocimiento y escisión del ARNm por la toxina MazF y su regulación por la antitoxina MazE en Bacillus subtilis. mol. Celda 52, 447–458 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Hogrel, G. et al. La estructura helicoidal inducida por nucleótidos cíclicos activa un efector inmune TIR. Naturaleza 608, 808–812 (2022).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Paget, MS Factores sigma bacterianos y factores anti-sigma: estructura, función y distribución. Biomoléculas 5, 1245–1265 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Sineva, E., Savkina, M. & Ades, SE Temas y variaciones en la regulación génica por factores sigma de función extracitoplasmática (ECF). actual Opinión Microbiol. 36, 128–137 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Krissinel, E. & Henrick, K. Inferencia de ensamblajes macromoleculares del estado cristalino. J. Mol. Biol. 372, 774–797 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Schuster, CF & Bertram, R. Los sistemas de toxina-antitoxina son moduladores ubicuos y versátiles del destino de las células procarióticas. FEMS Microbiol. Letón. 340, 73–85 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Walsh, PN & Ahmad, SS Proteasas en la coagulación sanguínea. Ensayos Bioquímica. 38, 95–112 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Brown, MS, Ye, J., Rawson, RB & Goldstein, JL Proteólisis intramembrana regulada: un mecanismo de control conservado de bacterias a humanos. Celda 100, 391–398 (2000).

Artículo CAS Google Académico

Fei, X., Bell, TA, Barkow, SR, Baker, TA & Sauer, RT Base estructural del reconocimiento y despliegue de ClpXP de sustratos etiquetados con ssrA. eLife 9, e61496 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Hu, C. et al. Craspase es una proteasa activada por ARN guiada por ARN CRISPR. Ciencia 377, 1278–1285 (2022).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

van Beljouw, SPB et al. El efector gRAMP CRISPR-Cas es una endonucleasa de ARN complejada con una peptidasa similar a una caspasa. Ciencia 373, 1349–1353 (2021).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Kato, K. et al. Escisión de proteínas activada por ARN y detención del crecimiento celular por la nucleasa-proteasa CRISPR tipo III-E. Ciencia 378, 882–889 (2022).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Strecker, J. et al. Escisión de proteína activada por ARN con una endopeptidasa asociada a CRISPR. Ciencia 378, 874–881 (2022).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Tunyasuvunakool, K. et al. Predicción altamente precisa de la estructura proteica del proteoma humano. Naturaleza 596, 590–596 (2021).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Robert, X. & Gouet, P. Descifrando características clave en estructuras de proteínas con el nuevo servidor ENDscript. Ácidos Nucleicos Res. 42, W320–W324 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Liu, H. & Naismith, JH Un protocolo eficaz de mutagénesis de plásmido de un solo paso dirigido al sitio, inserción y sitio único. BMC Biotecnología. 8, 91 (2008).

Artículo Google Académico

Rouillon, C., Athukoralage, JS, Graham, S., Grüschow, S. & White, MF Investigación de la vía de señalización del oligoadenilato cíclico de los sistemas CRISPR de tipo III. Métodos Enzymol. 616, 191–218 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Cianci, M. et al. P13, la línea de luz de cristalografía macromolecular EMBL en el anillo PETRA III de baja emitancia para la fase de alta y baja energía con enfoque de haz variable. J. Radiación de sincrotrón. 24, 323–332 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Kabsch, W. Indexación automática de patrones de difracción de rotación. Aplicación J. cristalogr. 21, 67–72 (1988).

Artículo CAS Google Académico

Liebschner, D. et al. Determinación de la estructura macromolecular mediante rayos X, neutrones y electrones: desarrollos recientes en Phenix. Acta Crystallogr. Estructura D. Biol. 75, 861–877 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr. D 60, 2126–2132 (2004).

Artículo Google Académico

Williams, CJ et al. MolProbity: más y mejores datos de referencia para una mejor validación de la estructura de todos los átomos. Ciencia de las proteínas 27, 293–315 (2018).

Artículo CAS Google Académico

McCoy, AJ et al. Software cristalográfico Phaser. Aplicación J. cristalogr. 40, 658–674 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Blanchet, CE et al. Entornos de muestras versátiles y automatización para experimentos de dispersión de rayos X de soluciones biológicas en la línea de luz P12 (PETRA III, DESY). Aplicación J. cristalogr. 48, 431–443 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Graewert, MA et al. Agregar cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y dispositivos de dispersión de luz (LS) para obtener datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) de alta calidad. Cristales 10, 975 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Franke, D., Kikhney, AG y Svergun, DI Adquisición y análisis automatizados de datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño. Núcleo instrumento Métodos Phys. Res. A 689, 52–59 (2012).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Konarev, PV, Volkov, VV, Sokolova, AV, Koch, MHJ & Svergun, DI PRIMUS: un sistema basado en PC con Windows para el análisis de datos de dispersión de ángulo pequeño. Aplicación J. cristalogr. 36, 1277–1282 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Manalastas-Cantos, K. et al. ATSAS 3.0: funcionalidad ampliada y nuevas herramientas para el análisis de datos de dispersión de ángulo pequeño. Aplicación J. cristalogr. 54, 343–355 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Svergun, D., Barberato, C. & Koch, MHJ CRYSOL: un programa para evaluar la dispersión de macromoléculas biológicas en solución de rayos X a partir de coordenadas atómicas. Aplicación J. cristalogr. 28, 768–773 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Franke, D. & Svergun, DI DAMMIF, un programa para la determinación rápida de la forma ab-initio en dispersión de ángulo pequeño. Aplicación J. cristalogr. 42, 342–346 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Svergun, DI Restauración de la estructura de baja resolución de macromoléculas biológicas a partir de la dispersión de la solución mediante recocido simulado. Biografía. J. 76, 2879–2886 (1999).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Volkov, VV & Dmitri, IS Singularidad de la determinación de la forma ab initio en la dispersión de ángulo pequeño. Aplicación J. cristalogr. 36, 860–864 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Kozin, MB & Svergun, DI Correspondencia automatizada de modelos estructurales de alta y baja resolución. Aplicación J. cristalogr. 34, 33–41 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Petoukhov, MV et al. Nuevos desarrollos en el paquete del programa ATSAS para el análisis de datos de dispersión de ángulo pequeño. Aplicación J. cristalogr. 45, 342–350 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Milov, A., Salikohov, K. y Shirov, M. Aplicación de Endor en el eco de espín de electrones para la distribución espacial del centro paramagnético en sólidos. Fizika Tverdogo Tela 23, 975–982 (1981).

CAS Google Académico

Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G. y Spiess, HW Medición libre de tiempo muerto de las interacciones dipolo-dipolo entre espines de electrones. J. magn. resonancia 142, 331–340 (2000).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Larsen, RG & Singel, DJ Modulación de eco de espín de resonancia de doble electrón-electrón: medición espectroscópica de separaciones de pares de espín de electrones en sólidos desordenados por orientación. J. Chem. física 98, 5134–5146 (1993).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Worswick, SG, Spencer, JA, Jeschke, G. & Kuprov, I. Procesamiento de redes neuronales profundas de datos DEER. ciencia Adv. 4, eaat5218 (2018).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Fábregas Ibáñez, L., Jeschke, G. & Stoll, S. DeerLab: un paquete de software integral para analizar datos de espectroscopia de resonancia paramagnética de electrones dipolares. Magn. resonancia 1, 209–224 (2020).

Artículo Google Académico

Jeschke, G., Chechik, V., Ionita, P. & Godt, A. DeerAnalysis2006: un paquete de software completo para analizar datos ELDOR pulsados. aplicación Magn. resonancia 30, 473–498 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Mirdita, M. et al. ColabFold: hacer que el plegamiento de proteínas sea accesible para todos. Nat. Métodos 19, 679–682 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Cha, SS et al. Estructura cristalina de la proteasa Lon: arquitectura molecular de la puerta de entrada a una cámara de degradación secuestrada. EMBO J. 29, 3520–3530 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Chung, IYW & Paetzel, M. Estructura cristalina de un complejo acil-enzima intramolecular de proteasa viral. J. Biol. química 286, 12475–12482 (2011).

Léa, MC et al. Bacterial RadA es una helicasa de tipo DnaB que interactúa con RecA para promover la extensión bidireccional del bucle D. Nat. común 8, 15638 (2017).

Zorzini, V. et al. Reconocimiento de sustrato y regulación de la actividad de la endonucleasa de ARNm MazF de Escherichia coli. J. Biol. química 291, 10950–10960 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Hagelueken, G., Ward, R., Naismith, JH y Schiemann, O. MtsslWizard: etiquetado de giro in silico y generación de distribuciones de distancia en PyMOL. aplicación Magn. resonancia 42, 377–391 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Campagne, S., Marsh, ME, Capitani, G., Vorholt, JA y Allain, FHT Base estructural para la fusión del elemento promotor −10 por factores sigma inducidos por el medio ambiente. Nat. Estructura. mol. Biol. 21, 269–276 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Lane, WJ & Darst, SA La base estructural para el reconocimiento del elemento promotor −35 por los factores σ del grupo IV. PLoS Biol. 4, e269 (2006).

Artículo Google Académico

Li, L., Fang, C., Zhuang, N., Wang, T. y Zhang, Y. Base estructural para el inicio de la transcripción por factores bacterianos ECF σ. Nat. común 10, 1153 (2019).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Descargar referencias

Los datos del sincrotrón MX se recopilaron en la línea de luz P13, operada por el personal de EMBL Hamburgo en el anillo de almacenamiento PETRA III (DESY, Hamburgo, Alemania). Damos las gracias a G. Bourenkov y I. Bento por la ayuda en el uso de la línea de luz; V. Siksnys por sus útiles debates; S. Shirran y S. Synowsky por el análisis de la EM; N. Brenner por la asistencia técnica; y M. Drag y J. Grzymska por las discusiones y un examen inicial de péptidos. MG y JLS-B. están financiados por Deutsche Forschungsgemeinschaft bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania–EXC2151–390873048. MFW reconoce una subvención avanzada del Consejo Europeo de Investigación (número de subvención 101018608) y el Consejo de Becas de China (referencia 202008420207 a HC). BEB reconoce la financiación de equipos EPR por parte de BBSRC (BB/R013780/1 y BB/T017740/1). GH agradece la financiación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención número HA6805/6-1).

Estos autores contribuyeron igualmente: Christophe Rouillon, Niels Schneberger

Instituto de Biología Estructural, Universidad de Bonn, Bonn, Alemania

Christophe Rouillon, Niels Schneberger, Jonas Moecking, Martin F. Peter, Matthias Geyer y Gregor Hagelueken

Instituto Max Planck de Neurobiología del Comportamiento—Cesar, Bonn, Alemania

Christophe Rouillon, Wolfgang Boenigk y Reinhard Seifert

Escuela de Biología, Universidad de St Andrews, St Andrews, Reino Unido

Haotian Chi y Malcolm F. White

Instituto de Química Clínica y Farmacología Clínica, Universidad de Bonn y Hospital Universitario de Bonn, Bonn, Alemania

Katja Blumenstock y Jonathan L. Schmid-Burgk

Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), sede de Hamburgo, Hamburgo, Alemania

Stefano Da Vela y Dmitri Svergun

Escuela de Química EastCHEM, Complejo de Investigación de Ciencias Biomédicas y Centro de Resonancia Magnética, Universidad de St Andrews, North Haugh, St Andrews, Reino Unido

Katrin Ackermann y Bela E. Bode

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

CR y GH concibieron y supervisaron el estudio y realizaron experimentos iniciales de expresión y cristalización de proteínas utilizando CalpL. RS y WB clonaron la construcción CalpL inicial. Experimentos diseñados por NS, CR, MFW y GH. NS optimizó la purificación de CalpL y CalpT, cristalizó CalpL, CalpL–cA4 y CalpL–CalpT10 y estableció y realizó los ensayos de escisión, los experimentos SEC–MALS y DLS. NS y MFP clonaron todas las construcciones mutantes. GH y NS resolvieron y refinaron las estructuras CalpL, CalpL–cA4 y CalpL–CalpT10. JM y MG diseñaron y realizaron los experimentos SPR. HC y MFW planificado y realizado los ensayos de ribonucleasa. HC, NS y MFW clonaron y purificaron CalpS y realizaron los experimentos de unión y coexpresión relacionados con CalpS. SDV realizó los experimentos SAXS. SDV y DS realizaron análisis e interpretación de datos SAXS y escribieron las secciones correspondientes. BEB y KA realizaron los experimentos de EPR pulsada, analizaron los datos, prepararon figuras y escribieron las secciones correspondientes. KB y JLS-B. diseñó y realizó los ensayos de secuenciación de RNase. CR, MFW, HC, NS y GH analizaron los datos y redactaron el documento. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito en todas las etapas.

Correspondencia a Christophe Rouillon o Gregor Hagelueken.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Simon Jackson, David Taylor y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Cromatografía de filtración en gel (Superdex 200 16/60) de CalpL. Recuadro: análisis SDS-PAGE de las fracciones indicadas por la barra azul en el cromatograma. El experimento se realizó varias veces (n > 3 réplicas biológicas). b, predicción TM por el servidor TMHMM 2.028 vs estructura experimental. c, Densidad electrónica representativa de la estructura cristalina SeMet CalpL. El modelo estructural se dibuja en representación de bola y palo. Los residuos seleccionados están etiquetados. La malla negra es un mapa de densidad de electrones de 2mFo-DFc contorneado en 1,0 σ. d, Diagrama de topología de CalpL. Para obtener datos de la fuente de gel, consulte la Fig. 1 complementaria.

Datos fuente

a, CalpL se dibuja como un modelo de caricatura codificado por colores como en la Fig. 1. La proteasa Lon de T. onnorineus (PDB-ID: 3K1J, DALI Z-score: 12.8)76 se muestra como un modelo de caricatura blanco. b, Tabla que enumera proteínas con estructuras de dominio similares 17,23,27,29,30,76,77,78. c, electrostática superficial de la región del sitio activo de la proteasa Lon. La díada catalítica está marcada. La línea gris marca el sitio probable de unión al sustrato. d, superposición del sitio activo de CalpL con el intermedio acil-enzima de la proteasa del virus de la ascitis de aleta amarilla. CalpL está en representación de barras y está codificado por colores como en la Fig. 1. La cadena D de la estructura 4IZJ27 (residuos 630-640) se superpuso a los residuos correspondientes de CalpL (150-160) lo que llevó a un rmsd de 0,314 Å. De 4IZJ, solo el intermedio de acil-enzima se muestra en modo de barras. Se indican los residuos seleccionados y las posiciones de los sitios P1-P3. e, Superposición de CalpL (esquema de colores como en la Fig. 1) con la proteína Cap4 (blanco, PDB-ID: 6VM6)23. f, Superposición del dominio CalpL SAVED (esquema de colores como en la Fig. 1) con la proteína Can1 (blanco, PDB-ID: 6SCE)17. g, Superposición del dominio CalpL SAVED (esquema de colores como en la Fig. 1) con los dominios CARF de la proteína Cap5 (blanco, PDB-ID: 7RWK)29.

a, Primer plano de cA4 (verde) unido al dominio GUARDADO de CalpL. La malla azul es un mapa de densidad de electrones de 2mFo-DFc contorneado en 1,0 σ. b, Superposición de CalpL apo (blanco) sobre la estructura compleja cA4 (codificada por colores como en la Fig. 1). c, Alineación estructural de los dominios SALVADOS de CALP/cA4 y Cap4/cA3 (blanco).

a, b, una superposición de la estructura CalpT predicha (compárese con la Fig. 2B) con un monómero del complejo MazF/ssRNA (púrpura/naranja) (PDB-ID: 5CR2)79. La confianza de predicción AlphaFold233 se mapea en la estructura CalpT (pLDDT48, prueba de diferencia de distancia local prevista). b, Una superposición de la estructura CalpT predicha (compárese con la Fig. 2b) con un monómero del complejo MazE/F (PDB-ID: 4ME7)35. La confianza de predicción AlphaFold233 se mapea en la estructura CalpT (pLDDT48, prueba de diferencia de distancia local prevista). c, Cromatografía de filtración en gel (Superdex 75 16/60) de CalpT El experimento se realizó múltiples veces (n > 3 réplicas biológicas). De acuerdo con los datos de MALS en la Fig. 3, CalpT aislado se comporta como un monómero. Recuadro: análisis SDS-PAGE de las fracciones indicadas por la barra azul. d, Huellas dactilares peptídicas de las bandas de división. Las bandas de gel indicadas se cortaron del gel y se enviaron para su identificación en las instalaciones de espectrometría de masas y proteómica de la Universidad de St Andrews (Fife, Reino Unido, https://mass-spec.wp.st-andrews.ac.uk) . Las letras rojas indican péptidos que se identificaron en la muestra respectiva. El experimento se realizó una vez. e, Análisis mutacional de sitios potenciales de escisión de CalpL en CalpT. El experimento se realizó varias veces (n > 3 repeticiones técnicas). Para obtener datos de la fuente de gel, consulte la Fig. 1 complementaria.

Datos fuente

a, Datos SPR de cinética de ciclo único de la interacción CalpL/T. La interacción es muy fuerte pero no puede ajustarse satisfactoriamente con un modelo vinculante 1:1. El experimento se realizó dos veces (n = 2 repeticiones técnicas). b, como a), pero en este experimento se usó como analito una construcción artificial de un VHH inespecífico fusionado con CalpT. La interacción es muy similar a la interacción CalpL/T. El experimento se realizó dos veces (n = 2 repeticiones técnicas). c, Esquemas de dos construcciones artificiales que contienen el sitio de escisión de CalpL. d, CalpL escinde una construcción artificial de un VHH inespecífico fusionado con CalpT10 pero no una construcción de dos VHH fusionados por el sitio de escisión de CalpL. El experimento se realizó una vez. e, trazas SEC-MALS (líneas continuas: UV280, líneas discontinuas: MWMALS) de reacciones de proteólisis con diferentes combinaciones de CalpL S152A, CalpT y cA4. El esquema indica las especies moleculares detrás de los picos individuales. Los experimentos se realizaron dos veces con condiciones de tampón ligeramente diferentes (n = 2 repeticiones técnicas). f, Unión de CalpL wt a los mutantes de CalpT indicados en ausencia de cA4. El esquema indica la posición del mutante en el complejo CalpL/T. Los experimentos se realizaron una vez. g, Densidad electrónica representativa de la estructura cristalina CalpL/T10. Los residuos seleccionados están etiquetados. La malla negra es un mapa de densidad de electrones de 2mFo-DFc contorneado en 1,0 σ. h, experimento SEC-SAXS del complejo CalpL/T10. El experimento se realizó una vez. Se recogieron y promediaron treinta marcos de intensidad de muestra y sesenta marcos de intensidad de tampón. Para cada conjunto de datos y punto angular, los errores se calcularon siguiendo las estadísticas de Poisson. Los puntos de datos representan la diferencia de intensidad promedio (muestra-tampón) y las barras de error representan la desviación estándar. Para obtener datos de la fuente de gel, consulte la Fig. 1 complementaria.

Datos fuente

a, Experimentos de dispersión de luz dinámica (seis series temporales, cada serie marcada con un círculo discontinuo, se muestran puntos de datos individuales) a diferentes concentraciones de proteína y en ausencia (t = 0: gris claro a t = 60 min: gris oscuro) y presencia (t = 0: cian a t = 60 min: violeta) de cA4 revelan una oligomerización de CalpL dependiente de cA4. El experimento se realizó dos veces (n = 2 repeticiones técnicas) b, experimentos SAXS a diferentes concentraciones. Los experimentos se realizaron una vez. Para cada experimento, se recolectaron y promediaron treinta marcos de intensidad de muestra y sesenta marcos de intensidad de tampón. Para cada conjunto de datos y punto angular, los errores se calcularon siguiendo las estadísticas de Poisson. Los puntos de datos representan la diferencia de intensidad promedio (muestra-tampón) y las barras de error representan la desviación estándar. c, Ab initio/modelo de cuerpo rígido de un dímero CalpL creado con DAMMIF y SASREFMX mediante un ajuste global de una mezcla de monómero-dímero a las diferentes concentraciones (líneas rojas). La estructura cristalina del monómero CalpL se muestra en la misma escala.

Datos fuente

a, Imagen de fluorescencia de la PAGE desnaturalizante para determinar la actividad de la ribonucleasa de las reacciones en b) frente a seis sustratos de ARN marcados con fluorescencia (enumerados en c)). No se observó escisión después de 30 min de incubación con ARN a 60 °C. El experimento se realizó tres veces (n = 3 réplicas biológicas) b, análisis SDS-PAGE de la escisión inducida por cA4 de CalpT (33 kDa) por CalpL. La escisión se completa después de 60 min a 60 °C. El experimento se realizó tres veces (n = 3 réplicas biológicas) c, Secuencias de los sustratos de ARN d, izquierda: MazF se incubó con una biblioteca de ARN monocatenario que contenía 10 bases aleatorias. Se usó la secuenciación de Illumina para verificar las secuencias que fueron escindidas por MazF. En comparación con una reacción de control sin MazF, las secuencias que contenían el sitio diana de MazF conocido (ACA) se agotaron. derecha: mismo experimento pero con CalpL/T ± cA4 en lugar de MazF. No se observaron secuencias fuera de la diagonal y, por lo tanto, no se observó actividad de ssRNasa. El experimento se realizó dos veces (n = 2 réplicas biológicas). e, Oligonucleótidos para los experimentos en d) f, Modelos de dímero AlphaFold2 de CalpT23. g, Mejor modelo (pLDDT48, prueba de diferencia de distancia local predicha) que incluye MTSSL spin label80. h, espectro cw-EPR de banda X de CalpL/T E119R1. La cantidad de etiqueta libre (puntas afiladas) es ~10%. La eficiencia de etiquetado determinada como ~100%. i, trazas temporales PELDOR de CalpL/T E119R1 en presencia (rojo) y ausencia (negro) de cA4. j, Distribuciones de consenso y bandas de incertidumbre correspondientes. Las barras de colores indican los rangos de fiabilidad (verde: forma fiable; amarillo: media y anchura fiable; naranja: media fiable; rojo: no es posible cuantificar). Distancia pronosticada calculada con mtsslWizard80. El experimento EPR se realizó dos veces (n = 2 repeticiones técnicas). Para obtener datos de la fuente de gel, consulte la Fig. 1 complementaria.

Datos fuente

a, Predicción de CalpS solo. La proteína se muestra como una caricatura y se colorea de acuerdo con la confianza de predicción (pLDDT48, prueba de diferencia de distancia local predicha) b, Predicción del complejo CalpT/S. c, la superposición de CalpS con 4LUP81 y 2H2782 identifica las regiones de unión al ADN de CalpS. d, Modelo de CalpS en el contexto de un complejo promotor/factor σ RNAP/ECF (PDB: 5ZX283, gris, amarillo, verde) de M. tuberculosis. Tenga en cuenta que la región enlazadora entre las subunidades σ2 y σ4 de CalpS se ha cortado para permitir la superposición de los dominios σ2 y σ4 en los de 5ZX2. El enlazador es lo suficientemente largo para unirse al RNAP de manera similar al factor σ en la estructura 5ZX2 (amarillo).

Versiones sin recortar y sin editar de todos los geles utilizados en este estudio.

Springer Nature o su licenciante (p. ej., una sociedad u otro socio) posee los derechos exclusivos de este artículo en virtud de un acuerdo de publicación con los autores u otros titulares de derechos; el autoarchivo del autor de la versión manuscrita aceptada de este artículo se rige únicamente por los términos de dicho acuerdo de publicación y la ley aplicable.

Reimpresiones y permisos

Rouillon, C., Schneberger, N., Chi, H. et al. Señalización antiviral por una proteasa CRISPR activada por nucleótidos cíclicos. Naturaleza 614, 168–174 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05571-7

Descargar cita

Recibido: 06 Diciembre 2021

Aceptado: 17 de noviembre de 2022

Publicado: 24 noviembre 2022

Fecha de emisión: 02 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05571-7

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.