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Jul 17, 2023

El péptido CLE33 reprime la diferenciación del floema mediante señalización autocrina y paracrina en Arabidopsis

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 588 (2023) Citar este artículo

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Los meristemas vegetales requieren un suministro constante de fotoasimilados y hormonas para las células meristemáticas en división. En la raíz en crecimiento, dicho suministro es entregado por elementos de tamiz de protofloema. Debido a su función preeminente para el meristemo apical de la raíz, el protofloema es el primer tejido en diferenciarse. Este proceso está regulado por un circuito genético que involucra por un lado a los reguladores positivos DOF ​​transcription factores, OCTOPUS (OPS) y BREVIX RADIX (BRX), y por otro lado a los reguladores negativos CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION RELATED (CLE) péptidos y sus receptores afines BARELY ANY MERISTEM (BAM) quinasas similares a receptores. Los mutantes brx y ops albergan un protofloema discontinuo que se puede rescatar por completo mediante una mutación en BAM3, pero solo se rescata parcialmente cuando los tres genes CLE específicos del floema conocidos, CLE25/26/45, se mutan simultáneamente. Aquí identificamos un gen CLE estrechamente relacionado con CLE45, llamado CLE33. Mostramos que el doble mutante cle33cle45 suprime completamente el fenotipo del protofloema brx y ops. Los ortólogos CLE33 se encuentran en angiospermas basales, monocotiledóneas y eudicotiledóneas, y la duplicación del gen que dio lugar a CLE45 en Arabidopsis y otras Brassicaceae parece ser un evento reciente. Por lo tanto, descubrimos un gen CLE de Arabidopsis no identificado previamente que es un jugador esencial en la formación del protofloema.

En las plantas vasculares, los tejidos del floema transportan azúcares y moléculas de señalización a los órganos de drenaje para su crecimiento y almacenamiento1,2. En la raíz de Arabidopsis en crecimiento, el meristemo apical de la raíz es un gran sumidero y dos polos del floema, que contienen elementos de tamiz funcionales, descargan la savia del floema en la región meristemática3. Cada polo consta de un elemento criboso de protofloema, flanqueado por dos células de periciclo del polo del floema desde el exterior, y un elemento criboso de metafloema desde el interior, y dos células acompañantes adyacentes a estas células del elemento criboso. Esta estructura compleja actúa como una unidad funcional4. Sorprendentemente, la entrega de azúcares y hormonas al meristemo de la raíz está mediada únicamente por los elementos del tamiz del protofloema, mientras que los elementos del tamiz del metafloema permanecen indiferenciados en esta región de la raíz5.

El proceso de formación de elementos cribosos del protofloema requiere modificaciones celulares radicales, incluido el refuerzo de la pared celular, la enucleación y la formación de placas cribosas6,7. El control genético del desarrollo del protofloema en Arabidopsis se ha estudiado intensamente en la última década4,6,8,9,10,11, incluido el análisis transcriptómico preciso de todo el polo del floema4 y los elementos cribosos en desarrollo6. La diferenciación del protofloema está controlada por múltiples reguladores, como gradientes hormonales, factores de transcripción DOF y represores transcripcionales SMXL9,12. Además, dos proteínas localizadas en la membrana, BREVIS RADIX (BRX) y OCTOPUS (OPS) actúan como reguladores positivos del desarrollo del protofloema8,10. Los mutantes con pérdida de función brx y ops muestran un protofloema discontinuo, caracterizado por las llamadas células gap que no logran diferenciarse. La continuidad interrumpida del protofloema da como resultado una entrega reducida de savia del floema al meristema apical de la raíz y un crecimiento limitado de la raíz8,10. APENAS NINGÚN MERISTEM 3 (BAM3) se identificó en una pantalla supresora de brx con bam3 rescatando tanto el crecimiento de la raíz como los fenotipos de células gap de brx y ops10. BAM3 codifica para una quinasa receptora de repetición rica en leucina (LRR-RLK), un receptor afín del péptido CLAVATA3/REGIÓN ALREDEDOR DEL EMBRIÓN 45 (CLE45)13. Si bien se ha demostrado recientemente que un mutante de orden superior de los genes CLE expresados ​​en el floema (CLE25/26/45) rescata parcialmente el fenotipo de células brx y ops gap, este rescate no está al nivel del rescate completo logrado en bam314. Esta discrepancia fenotípica entre el receptor y sus ligandos sugiere que quedan por identificar péptidos CLE endógenos adicionales, ligandos BAM3.

Los péptidos CLE se producen a partir de un prepropéptido de aproximadamente 100 aminoácidos que posee un péptido señal en su extremo N para la liberación apoplástica, una región variable central y un dominio CLE conservado de 12 a 13 residuos en su extremo C, que se escinde apagado para liberar el péptido CLE maduro. Dado el pequeño tamaño de sus genes y la alta variabilidad de secuencias fuera del dominio CLE, la anotación del genoma de los genes CLE puede ser un desafío. En Arabidopsis, sus descubrimientos provinieron inicialmente de una pantalla mutante15,16, luego de la clonación de CLV317. El primer lanzamiento del genoma de Arabidopsis18 permitió la identificación de miembros adicionales de la familia CLE en varias iteraciones19,20,21,22,23. Hasta la fecha, se han anotado 32 genes CLE que codifican 27 péptidos únicos. Recientemente exploramos la familia de genes CLE en el tomate y encontramos 37 nuevos genes CLE24, lo que genera la pregunta de si quedan genes CLE adicionales por descubrir en Arabidopsis.

Aquí presentamos la identificación del gen Arabidopsis CLE33, que se perdió en los análisis del genoma anteriores. Mostramos que este gen se expresa en el floema de la raíz en desarrollo y codifica para un péptido activo que actúa de manera redundante con CLE45 a través del receptor BAM3 para inhibir la diferenciación del protofloema en el linaje celular del protofloema y las células vecinas.

Para buscar genes CLE de Arabidopsis adicionales, realizamos un análisis t-BLAST-n no estricto utilizando las 32 proteínas CLE de longitud completa conocidas previamente de A. thaliana como consultas. Encontramos una secuencia en una región no anotada del cromosoma 1 que muestra todas las características de un gen CLE, incluida la presencia de un péptido señal funcional. En otras especies de Brassicaceae, este locus genético se conserva y se anota como un homólogo similar a CLE45 (Fig. 1a complementaria). En A. thaliana, este locus se transcribe, lo que confirma la expresión del gen, que llamamos CLE33 (Fig. 1b y Fig. 1b complementaria). En función de su secuencia de proteína de longitud completa, determinamos que CLE33 es el homólogo más cercano del CLE45 expresado en floema bien caracterizado (Fig. 1a) 10,11,13.

un árbol filogenético de pre-propéptidos CLE de longitud completa de Arabidopsis thaliana. La línea azul indica el grupo expresado en el tejido del floema de la raíz. b Evidencia de transcripción basada en ARN-seq de Araport11 a partir de la cobertura de mapeo de las plántulas de crecimiento ligero visualizadas con JBrowse. La posición relativa de la secuencia codificante de CLE33 pronosticada se indica esquemáticamente: péptido señal en verde, dominio CLE en azul. c Fusiones transcripcionales que muestran la actividad promotora de CLE33, CLE45 y CLE26 en el tejido del protofloema de la raíz. Barra de escala = 50 μm.

Para obtener información sobre el patrón de expresión de CLE33, clonamos su región promotora para impulsar un reportero GUS (Figura complementaria 1c). La expresión de CLE33 se asoció específicamente con la vasculatura en el meristema de la raíz, la unión de la roseta y las hojas, los cotiledones y el tallo de la inflorescencia. Para determinar con precisión el tejido expresado, usamos el mismo promotor y dos CLE adicionales específicos del floema (CLE26 y CLE45) para impulsar la expresión de la proteína fluorescente nuclear NLS-Citrine (Fig. 1c y Fig. 1d complementaria). En el meristema de la raíz, los tres se expresan específicamente en el tejido del protofloema, pero con ligeras diferencias en el inicio de la expresión. La expresión de CLE45 puede observarse temprano en las células precursoras del elemento criboso, inmediatamente después de la primera división celular periclinal del precursor del procambium del elemento criboso. La expresión de CLE33 comienza unas pocas células más tarde, en las células del elemento criboso del protofloema en desarrollo, superponiéndose en gran medida con el dominio de expresión de CLE45. CLE26 está activo en las últimas etapas de la diferenciación de elementos cribosos, cuando se ha producido el engrosamiento de la pared celular, de acuerdo con los reporteros publicados anteriormente25,26.

La mayoría de los péptidos CLE inducen la detención del crecimiento de la raíz cuando se sobreexpresan o cuando se agregan a los medios de crecimiento en concentraciones nanomolares y, por lo tanto, se denominan activos para la raíz13,26. Para determinar si el péptido CLE33 también podría inhibir el crecimiento de la raíz primaria y qué receptores están involucrados en la percepción de este péptido en el meristemo de la raíz, aplicamos el péptido CLE33 a una concentración creciente de 0 a 300 nM en los medios de crecimiento y evaluamos el efecto de inhibición del crecimiento de la raíz en el medio de crecimiento. mutantes del receptor CLE de tipo salvaje y con pérdida de función (Fig. 2a). En el tipo salvaje, el crecimiento de la raíz se inhibió con 3 nM de CLE33, volviéndose más pronunciado con concentraciones más altas. En cuanto a otros CLEs activos en las raíces conocidos, esta respuesta fue totalmente dependiente de CLV2/CORYNE13, incluso en las concentraciones más altas. Por el contrario, los mutantes bam exhibieron una variedad de respuestas. bam2-4 mostró una sensibilidad similar al tipo salvaje, mientras que bam1-3 fue hipersensible a CLE33p. Esta hipersensibilidad de alrededor de 3 veces también se observó con los péptidos CLE26 y CLE45 (Figura complementaria 2a, b), y con el péptido CLE33 en el alelo bam1-4 independiente (Figura complementaria 2d). Por otro lado, los mutantes bam3 fueron insensibles hasta 100 nM del péptido CLE33 y solo mostraron una respuesta a una concentración muy alta de 300 nM (Fig. 2a y Fig. 2c complementaria). Solo en combinación con la pérdida de función de BAM1, se logró una insensibilidad total, lo que sugiere que BAM1 juega un papel en la mediación de las respuestas de crecimiento de la raíz a los péptidos CLE33 sintéticos a alta concentración. Para probar aún más este hallazgo en condiciones fisiológicas más cercanas, utilizamos el sistema inducible de XVE-estradiol para expresar ectópicamente CLE33 (Fig. 3 complementaria). Mientras que el tipo salvaje reaccionó fuertemente a la inducción ectópica de CLE33, las líneas bam3-2 permanecieron insensibles incluso a altas concentraciones de estradiol. Estos resultados sugieren que los péptidos CLE33 sintéticos y endógenos requieren BAM3 para el efecto de inhibición del crecimiento de raíces.

a Inhibición del crecimiento de la raíz dependiente de la dosis por parte de CLE33p en mutantes del receptor CLE y de tipo salvaje. b Inhibición del crecimiento de raíces con péptidos sintéticos CLE33 (30 nM), CLE45 (30 nM), CLE26 (3 nM). c Inhibición del crecimiento de la raíz de las variantes del péptido CLE33 CLE33M2K, CLE33G4P, CLE33S7P (30 nM). a–c Las letras indican diferentes grupos estadísticos (ANOVA, prueba post hoc de Tukey).

Se demostró que BAM3 es el receptor afín del péptido 13 CLE45, y los mutantes bam3 presentan una insensibilidad similar a los péptidos CLE33 y CLE45 (Fig. 2b y Fig. 2a complementaria). Esta dependencia única de BAM3 es muy específica de los péptidos CLE33 y CLE45, pero no del péptido CLE26 estrechamente relacionado (Fig. 2b complementaria). Al comparar las secuencias de aminoácidos de estos tres péptidos, notamos que las prolinas conservadas en las posiciones 4 y 7 se reemplazan en CLE33 por glicina y serina, y en CLE45 por arginina y serina (Fig. 2b). Para investigar más a fondo la importancia de estos aminoácidos para la especificidad del receptor, creamos y probamos variantes de CLE26 y CLE33 intercambiando residuos entre estos dos péptidos. En primer lugar, observamos que todas las variantes peptídicas (CLE26P4G, CLE26P7S, CLE26P4G/P7S, CLE33M2K, CLE33G4P, CLE33S7P) tenían un fuerte efecto de inhibición del crecimiento de raíces en el tipo salvaje pero prácticamente ningún efecto en el mutante crn-10, lo que implica que los aminoácidos las sustituciones no afectaron su capacidad para suprimir el crecimiento de la raíz (Fig. 2c y Fig. 4 complementaria). Sin embargo, la dependencia de BAM3 dependía en gran medida de los residuos en las posiciones 4 y 7. La presencia de una prolina en la posición 4 o 7 en CLE33 condujo a una respuesta independiente de BAM3 (Fig. 2c), e inversamente ambas prolinas necesitaban ser reemplazadas en CLE26 para no inhibir el crecimiento de la raíz en el mutante bam3 (Fig. 4 complementaria). En conjunto, estos resultados sugieren que la ausencia de prolinas en las posiciones 4 y 7 determina la especificidad de percepción de BAM3 de los péptidos CLE33 y CLE45.

Se ha demostrado previamente que el desarrollo del protofloema de la raíz es suprimido por los péptidos CLE activos en la raíz que se agregan al medio de cultivo13. Para probar el efecto de CLE33 en la identidad del protofloema, evaluamos la expresión del marcador de protofloema pCVP2:NLS-3xVenus tras el tratamiento durante la noche del péptido CLE33 (Fig. 5 complementaria). El efecto inhibitorio de CLE33 sobre la identidad del protofloema fue similar al efecto de CLE26 y CLE45, lo que sugiere que CLE33 actúa como un regulador negativo de la diferenciación del protofloema.

Para comprender la función biológica de CLE33 en planta y su relación genética con CLE45, creamos mutantes knock-out mediados por CRISPR-Cas9 en fondos de tipo salvaje y cle45-2 (Fig. 6 complementaria). Al igual que bam3¸, los mutantes cle33 simple y cle33cle45 doble no muestran ningún macrofenotipo de crecimiento de raíces reproducible en nuestras condiciones (Fig. 3 y Fig. 7 complementaria). De acuerdo con informes anteriores, los mutantes con pérdida de función de BAM3 pueden rescatar por completo la diferenciación discontinua del protofloema de brx y ops8,10, lo que no es el caso de cle4514. Preguntamos si esta discrepancia fenotípica podría atribuirse a la presencia del CLE33 restante en el tejido del protofloema. Para explorar esto más a fondo, cruzamos el doble mutante cle33-3 cle45-2 con brx-3 y ops-2. La mutación en CLE33 sola tuvo un impacto nulo o muy pequeño en el rescate del crecimiento de la raíz y la continuidad del protofloema de brx-3 y ops-2 (Fig. 3 y Fig. 7 complementaria). Podríamos reproducir un resultado publicado anteriormente, donde cle45 suprimió parcialmente el fenotipo de crecimiento de la raíz, pero no logró reducir significativamente la frecuencia de las células de la brecha del protofloema14. La combinación de cle33 y cle45 podría rescatar por completo los fenotipos de crecimiento de la raíz y discontinuidad del protofloema, lo que sugiere fuertemente que CLE33 y CLE45 actúan de manera redundante en este circuito genético (Fig. 3 y Fig. 7 complementaria). Estos resultados tomados en conjunto apoyan un papel negativo para CLE33 en la diferenciación del protofloema.

a Longitud de la raíz a los 10 días después de la germinación. Las letras indican diferentes grupos estadísticos (ANOVA, prueba post hoc de Tukey). b Imágenes confocales representativas de raíces teñidas con blanco de calcoflúor. Las flechas rojas indican células gap de protofloema. Las barras de escala corresponden a 100 μm. c Cuantificación de frecuencia de celda de brecha. Las letras indican grupos estadísticos (prueba χ2 con corrección de Benjamini-Hochberg).

La falla en el desarrollo del protofloema causada por la pérdida de función de BRX u OPS podría explicarse por altas dosis del receptor BAM3 o ligandos CLE específicos del floema. Para probar esta posibilidad, cuantificamos la acumulación de transcritos en los tejidos de la raíz brx y ops. Descubrimos que, en el nivel transcripcional, BAM3 no está regulado al alza y CLE25, CLE26 y CLE45 incluso mostraron una reducción significativa en su expresión (Fig. 8a complementaria), lo que sugiere que el aumento de la señalización mediada por BAM3/CLE33/45 en brx y ops mutante es causado por otro mecanismo.

Al analizar la continuidad del protofloema, nos encontramos con un fenotipo adicional de células similares a elementos de tamiz ectópicos que se originaron en las células vecinas adyacentes al archivo principal de células de elementos de tamiz del protofloema. Estos archivos de celdas muestran características de elementos de tamiz en desarrollo, incluido el engrosamiento de la pared celular (Fig. 4a). Recientemente se mostró un fenotipo relacionado en los mutantes de pérdida de función múltiple en mutantes de floema CLE, receptor BAM y co-receptor CIK, lo que demostró que la señalización de CLE restringe la diferenciación de células vecinas en elementos cribosos9. Este análisis previo se realizó en una etapa posterior del desarrollo del floema cuando tanto los elementos del tamiz del protofloema como los elementos del tamiz del metafloema se han diferenciado y poseen paredes celulares gruesas9. En nuestros análisis, nos enfocamos en la zona meristemática. Cuantificamos la frecuencia de los eventos de diferenciación del protofloema ectópico en nuestros mutantes. Encontramos una mayor diferenciación ectópica en ausencia de BAM3 y en los mutantes triples cle33 cle45 brx y cle33 cle45 ops, pero no en las combinaciones de doble mutante (Fig. 4b y Fig. 8b complementaria). Esta diferencia podría deberse a una identidad de floema más débil en ausencia de brx y ops, y/o niveles reducidos de CLE25/CLE26 en estos fondos (Fig. 8a complementaria) que se sabe que reprimen la formación de elementos cribosos ectópicos9. Sin embargo, los resultados de nuestro análisis muestran que CLE33 y CLE45 actúan de manera redundante al inhibir la formación de elementos de tamiz de protofloema ectópico (Fig. 4c y Fig. 7 complementaria).

a Imágenes confocales de raíces teñidas con blanco de calcoflúor. Las flechas azules indican archivos de células que muestran un refuerzo de la pared celular, señal de que están experimentando un proceso de diferenciación de protofloema. Las barras de escala corresponden a 50 μm. b Frecuencia de diferenciación de protofloema ectópico en raíces. Las letras indican grupos estadísticos (prueba χ2 con corrección de Benjamini-Hochberg). c Modelo esquemático de señalización autocrina y paracrina mediada por los péptidos CLE33/45 a través del receptor BAM3.

Recientemente se ha demostrado que CLE25, CLE26 y CLE45 tienen sitios de unión al factor de transcripción DOF en su región promotora y son inducidos por DOF2.29. Nuestro análisis de la región del promotor CLE33 reveló sitios de unión similares para DOF2.2, DOF2.4/PEAR1, DOF3.2, OBP3, DOF5.1/PEAR2 y DOF5.6 (Fig. 8c complementaria). Este resultado sugiere que CLE33 puede ser un jugador esencial en el circuito genético DOF-CLE.

Los dos genes que codifican péptidos, CLE33 y CLE45 parecen ser funcionalmente redundantes (Figs. 3 y 4) y comparten una gran similitud de secuencia y patrón de expresión (Fig. 1). Por lo tanto, podrían ser el resultado de un evento de duplicación de genes. Para conocer su origen evolutivo, realizamos un análisis filogenético en diversas especies de plantas vasculares. Identificamos ortólogos CLE33 en los genomas de angiospermas basales, monocotiledóneas y eudicotiledóneas, pero no de gimnospermas, lo que sugiere que surgió hace ~ 200 millones de años (Fig. 9a complementaria). Curiosamente, solo se encontraron ortólogos claros de CLE45 en especies de Brassicales. Una alineación multisecuencial reveló que Brassicales CLE45 tiene una región variable extendida sin homología con otras proteínas similares a CLE33/45 en la parte N-terminal inmediatamente después del péptido señal (Fig. 9b complementaria). Sin embargo, al analizar específicamente el dominio CLE, observamos que CLE45 es más similar a los ortólogos ancestrales CLE33 (Fig. 9c complementaria). Una posibilidad de que esto ocurra es que después de una duplicación en los primeros Brassicales, una copia se desplazó rápidamente genéticamente en su región variable dando lugar al CLE45 actual. En tal escenario, Brassicales CLE33 mantuvo la mayor parte de la secuencia ancestral, a excepción de los residuos 2/3/4 en su dominio CLE. Sorprendentemente, todos los ortólogos de CLE33 y CLE45 no tienen prolinas en las posiciones 4 y 7, lo que encontramos que es consecuencia de la especificidad de percepción del receptor en Arabidopsis (Fig. 2).

Además, investigamos el origen evolutivo de BAM3, el gen que codifica para el receptor que percibe estos dos ligandos. Encontramos ortólogos presentes hasta las gimnospermas (Fig. 10 complementaria). Una duplicación temprana en las angiospermas produjo dos copias: BAM3 y BAM4. Mientras que BAM3 se encuentra en todos los grupos de angiospermas, BAM4 está peculiarmente ausente de los genomas de las especies de Brassicaceae. La pérdida de BAM4 coincide con la aparición de CLE45 en Brassicales. Sin embargo, los ligandos de BAM4 y sus funciones siguen siendo desconocidos. Nuestros hallazgos abren nuevas direcciones para una mayor exploración de estos pares de receptor-ligando y su función potencial conservada a lo largo de la evolución de la planta.

En los últimos años, se han descubierto muchos genes adicionales que codifican ligandos peptídicos en Arabidopsis y otras especies de plantas24,27,28,29,30,31. Estos pertenecen a familias previamente desconocidas, como los péptidos CTNIPs/SCREWs inducidos por estrés27,28, o familias de genes bien caracterizadas, como CIF/TWS131 y CLE en nuestro estudio. Parece que las anotaciones del genoma de las plantas, incluida Arabidopsis, todavía pierden muchos de estos genes que codifican péptidos. Sin embargo, métodos avanzados como el perfilado de ribosomas combinado con transcriptómica y peptidómica32,33 han mostrado un gran éxito en la identificación de algunos miles de tales genes en Medicago32 y maíz33. Además, los análisis de todo el genoma utilizando modelos ocultos de Markov34 condujeron a la identificación de nuevos péptidos24,35. Con la ayuda de métodos tan avanzados, pronto podremos obtener un repertorio completo de péptidos de señalización de plantas que regulan una miríada de respuestas adaptativas y de desarrollo.

En nuestro estudio, realizamos una búsqueda t-BLAST-n no estricta de genes CLE, lo que nos permitió identificar el CLE33 previamente no anotado. Las prolinas en las posiciones 4 y 7 se encuentran entre los aminoácidos más conservados en los péptidos CLE, y su ausencia en CLE33/45 los convierte en excepciones y explica en parte por qué estos genes se identificaron más tarde22. Desde un punto de vista estructural, el residuo de prolina confiere cambios conformacionales únicos debido a su geometría irregular36. La cadena lateral de la prolina se conecta dos veces al esqueleto peptídico, creando su propia estructura secundaria. Poco se sabe sobre la contribución de las prolinas a las interacciones con el receptor CLE y las superficies de unión del co-receptor. Sin embargo, se demostró que en los péptidos CLE maduros, las prolinas 4 y 7 experimentan hidroxilación y una o ambas experimentan glicosilación con 3, 4 o 6 residuos de arabinosa37. Se demostró que la hidroxiprolina en la posición 4 en el péptido CLE40 evita la escisión errónea del péptido precursor38. Al mismo tiempo, la ausencia o presencia de hidroxilación en el péptido CLE40 maduro y la sustitución de la prolina en la posición 4 por alanina (P4A), no afectaron la bioactividad del péptido en los ensayos de crecimiento de raíces38. Además, la sustitución de hidroxiprolinas en las posiciones 4 y 7 por prolinas en CLE9 no afectó la afinidad de unión a BAM1 in vitro39, lo que podría haber sugerido que la propia prolina 4 y la hidroxilación de prolina no son esenciales para la interacción péptido-receptor38,39. Sin embargo, nuestros ensayos de bioactividad con péptidos CLE26 y CLE33 modificados indican que las prolinas en las posiciones 4 y 7 son determinantes para la especificidad del receptor. Se ha demostrado que en BAM3, los residuos Q226Y228Y231 son cruciales para la unión de CLE4513, pero es necesario aclarar cómo la ausencia de prolinas 4 y 7 contribuyen a la unión específica con BAM3.

La aparición de elementos cribosos conductores de azúcar altamente especializados fue un paso crucial en la evolución de las plantas terrestres. Este invento facilitó la separación de los órganos fotosintéticos que necesitan competir por la luz y crecer hacia el sol, y los órganos absorbentes de agua que crecen profundamente en el suelo. Archivos de elementos de tamiz primitivos se pueden encontrar en especies de algas pardas y musgos40, que a menudo muestran solo una degradación y enucleación parcial de protoplastos. Todas las plantas vasculares sin flores, incluidas las gimnospermas, poseen células de tamiz, que tienen áreas de tamiz y no placas de tamiz en las paredes laterales y laterales41. En las gimnospermas, las células cribosas conductoras carecen de células acompañantes adyacentes y tienen forma de estructuras fusiformes alargadas que están conectadas axial y lateralmente por áreas cribosas con poros estrechos, lo que conduce a una mayor resistencia al flujo y velocidades de transporte más lentas. Las angiospermas desarrollan elementos de tamiz de floema aislados altamente eficientes con placas de tamiz en las paredes de los extremos, que facilitan el transporte rápido de fotoasimilados41,42. Aquí identificamos un nuevo jugador molecular en la formación del protofloema de la raíz, un pequeño gen de péptido de señalización CLE33. En la raíz de Arabidopsis, los factores de transcripción DOF específicos del floema inducen un conjunto de reguladores positivos del desarrollo del floema y CLE, que regulan a la baja la expresión del DOF en un circuito de retroalimentación9,12. Con sitios de unión DOF en su secuencia reguladora corriente arriba, es probable que CLE33 esté involucrado en este circuito genético. Demostramos que CLE33 actúa en conjunto con CLE45 para contrarrestar la diferenciación de elementos de tamiz mediada por BRX/OPS. Tal mecanismo puede potencialmente tener un papel en la definición del momento adecuado para la diferenciación del elemento tamiz dependiendo de las señales endógenas y las condiciones ambientales. Además, mostramos que CLE33 actúa de manera redundante con CLE45 para reprimir las células vecinas del protofloema para que no se diferencien en elementos de tamiz. Estos resultados sugieren que CLE33/45 actúa tanto como señales autocrinas como paracrinas, mientras que los otros dos genes CLE del floema (CLE25 y CLE26) tienen un papel limitado como señales autocrinas en el módulo BRX/OPS-BAM3 que regula la diferenciación del protofloema. Recientemente se demostró que otro participante en esta vía, RECEPTOR PROTEIN LIKE KINASE 2 (RPK2), está involucrado en la diferenciación del protofloema43. El mutante rpk2 con pérdida de función pudo rescatar parcialmente los fenotipos de la brecha del protofloema y el crecimiento de la raíz de los mutantes brx, ops o cvp2cvl143. Se demostró que RPK2 interactúa genéticamente con BAM1 y las dos proteínas forman complejos heteroméricos44, pero aún no se explora la posible interacción de RPK2 con BAM3.

La capacidad del elemento criboso del protofloema que rodea las células para convertirse en células del elemento criboso es importante para la plasticidad del desarrollo de este tejido43. La ablación con láser del protofloema en desarrollo desencadena la diferenciación de las células vecinas43, evitando el protofloema interrumpido original para mantener el suministro de azúcares y hormonas al meristemo. Parece que el equilibrio correcto entre la supresión y el mantenimiento del potencial de diferenciación para tamizar elementos en caso de falla es esencial para la función del protofloema. Queda por responder por qué el mantenimiento de un solo archivo de elemento criboso funcional tiene un control genético tan estricto.

En las plantas vasculares superiores, la vía CLAVATA se extendió en gran medida tanto a través del número de genes del péptido CLE como de nuevos componentes de los complejos receptores, incluidas las duplicaciones de CLV1/BAM-like RLK y la aparición de la proteína similar al receptor CLVATA2 y pseudoquinasa CORYNE45. Con los ortólogos CLE33 encontrados en las angiospermas basales, es posible que durante la evolución de la planta, se reclutaran CLE expresados ​​en el floema para dar forma al tejido único del floema de la angiosperma que funciona de manera eficiente en la rápida translocación de fotoasimilados.

Se realizó una búsqueda t-BLAST-n en el genoma de A. thaliana en la base de datos EnsemblPlant utilizando las 32 proteínas CLE de longitud completa previamente conocidas de A. thaliana como consultas. Para obtener más resultados, el umbral del valor e se estableció en 10 en lugar de la configuración original de 10−1. Las secuencias candidatas que no se anotaron como genes CLE se compararon manualmente con las consultas. Solo las secuencias similares al dominio CLE se analizaron adicionalmente para determinar la presencia de un péptido señal, prueba de expresión y no ser parte de otra proteína descrita. Después del filtrado, quedó una sola secuencia en una región no anotada del cromosoma 1 que poseía todas las características de un gen CLE: CLE33.

Todos los mutantes descritos en este estudio están en el fondo de Arabidopsis thaliana Columbia-0 (Col-0): clv2-113 crn-1013, bam1-3 (SALK_015302), bam1-4 (SALK_107290), bam2-4 (SAIL_1053_E09), bam3 -2 (SALK_044433)13, bam3-3 (SALK_118860), bam1-4 bam3-3, bam2-4 bam3-2, cle45-246, brx-347, ops-2 (SALK_139316)8.

Los mutantes de pérdida de función en CLE33 se generaron mediante la edición del gen base CRISPR-Cas9. El diseño de los ARN-guía con objetivos secundarios bajos se realizó mediante CCTop (10.1371/journal.pone.0124633). La generación del ARNg se logró mediante hibridación de dímeros de cebadores (C67xC68; C69xC70) y se clonó en el vector de destino pAGM5526148 mediante ligadura de corte BsaI. A. thaliana Col-0 de tipo salvaje y cle45-2 se transformaron mediante un baño floral en suspensión de Agrobacterium tumefaciens. Las semillas transgénicas se seleccionaron para fluorescencia DsRed. Las mutaciones generadoras de cambios de marco en CLE33 se buscaron en la progenie no transgénica. Los mutantes de orden superior se obtuvieron mediante cruce.

Los genes y las regiones promotoras se amplificaron mediante Phusion PCR con los cebadores indicados en la Tabla complementaria 1. Los plásmidos se construyeron como se indica en la Tabla complementaria 2 mediante ensamblaje modular Golden Gate49.

BLASTP buscó homólogos de CLE33/CLE45 y BAM3 en las bases de datos Phytozome13 y PLAZA Gymnosperm. No se encontraron indicios en Carica papaya y se realizó un t-BLAST-n para encontrar los homólogos de CLE33/45. Las secuencias de CLE de tomate se recuperaron de 24. Las secuencias de proteínas de longitud completa se alinearon usando MUSCLE y se curaron manualmente en MEGA-X50 para la Fig. 1a, o MAFFT con DASH habilitado51 para las Figs complementarias. S9 y S10. Las alineaciones se usaron para producir árboles con 1000 réplicas de arranque con IQTREE52 y se visualizaron con iTOL53. El análisis de sintenia de CLE33 en Brassicaceae se realizó con Genome Context Viewer54. Los perfiles de alineación de múltiples secuencias se compusieron con alineamientoviewer.org55. Los logotipos de conservación de secuencias fueron generados por WebLogo56.

Las semillas se colocaron en placas MS de concentración media de azúcar al 1 % complementadas o no con la concentración indicada de péptidos (Genescript, >75 % de pureza, disueltos en agua) o estradiol (la solución madre se diluyó en DMSO) o el solvente correspondiente, y se mantuvieron en oscuridad a 4 °C durante 48 h antes de ser transferidas a una cámara de crecimiento a 22 °C con ciclos de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Las plántulas se cultivaron durante 7 días para ensayos de inhibición del crecimiento de raíces por péptidos, o 10 días para la supresión genética de los fenotipos de crecimiento de raíces brx-3/ops-2. Después de escanear las placas con un escáner Epson a alta resolución (600 ppp), se midió la longitud de la raíz utilizando la herramienta de trazador de neurita única en Fiji.

La región promotora de CLE33 (876 pb desde el codón de inicio) se clonó para impulsar la expresión del sistema informador GUS. Las plántulas transgénicas se incubaron a 37 °C en tampón de tinción GUS (0,5 mg/ml de X-Gluc, tampón de fosfato 100 mM, EDTA 10 mM, ferricianuro de potasio 1 mM, ferrocianuro de potasio 1 mM, Triton X-100 al 0,1 %) y se aclararon en 70% de etanol. Las imágenes se tomaron con el microscopio Zeiss Axioplan y el estereomicroscopio Leica MDG36.

Para el análisis de expresión específico de células, se clonaron y usaron regiones aguas arriba de CLE26 (1615 pb), CLE45 (2513 pb) y CLE33 (876 pb) para impulsar la expresión de fusión localizada nuclear que consiste en H2B o NLS y citrino. Para el tratamiento con péptido, se transfirieron plántulas transgénicas homocigóticas pCVP2:NLS-3xVenus a las placas frescas que no contenían péptido, o 100 nM de CLE33p o CLE45p, 22 h antes de la fijación.

Las plántulas se fijaron con paraformaldehído al 4% (Sigma) en PBS durante 1 h como mínimo. Después de lavar con PBS, las muestras se tiñeron durante la noche con Calcofluor White al 0,2 % disuelto en una solución ClearSee57 y se aclararon con ClearSee durante al menos 48 h. Las imágenes se realizaron con un microscopio confocal de escaneo láser Leica TCS SP5 con los siguientes ajustes: pared celular teñida con calcoflúor (excitación a 405 nm, detección a 415–500 nm), Venus o Citrine (excitación a 514 nm, detección a 522– 574 nm o 524–600 nm).

Las hojas de N. bethamiana se transformaron transitoriamente por infiltración con A. tumefaciens que porta un plásmido multicassette que expresa pUbi:CLE33-mCherry y p35s:Venus. Después de 3 días, se tomaron imágenes secuenciales de los discos de hojas con un microscopio confocal de escaneo láser Leica TCS SP5 para Venus (emisión a 514 nm, detección de 524 a 551 nm) y mCherry (emisión a 561 nm, detección de 571 a 650 nm).

Se transfirieron plántulas de cinco días a placas nuevas que contenían estradiol 1 µM o la cantidad equivalente de disolvente (DMSO). Después de 16 horas, las plántulas se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras congeladas se trituraron en un molino con perlas de metal. El ARN se extrajo utilizando el kit MagMAX Plant RNA Isolation (Applied Biosystems). El resto del ADN se eliminó mediante precipitación con LiCl 2 M. La síntesis de ADNc se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc SensiFAST (Meridian). Las PCR cuantitativas se realizaron con Fast Start Universal SYBR-green Master (Roche), con cebadores de la Tabla complementaria 1. Las condiciones del termociclador (Mic qPCR Cycler, biomolecular systems) fueron: 95 °C 2 min, 45 ciclos de 95 °C 15 s, 58 °C 10 s, 60 °C 50 s, seguido de un análisis de la curva de disociación. Los valores de expresión se normalizaron a actina.

Realizamos análisis estadísticos usando R v4.0.2 dentro de la interfaz Rstudio. Utilizamos la transformación logarítmica para la longitud de la raíz y la identidad de la célula del protofloema QC-distancia. La significación estadística se determinó mediante ANOVA seguido de una prueba de Tukey post hoc para comparación múltiple. Para la frecuencia de las celdas de separación, empleamos una prueba de χ2 con una corrección del valor P de Benjamini-Hochberg. En general, el tamaño de la muestra se eligió con base en la variabilidad observada en los experimentos preliminares. Para los ensayos que involucran plántulas cultivadas en placas, se usaron múltiples placas por condiciones para limitar la variabilidad del efecto de la placa. Realizamos ensayos de crecimiento de raíces y análisis de protofloema de raíces al menos dos veces con resultados similares. El patrón de expresión de CLE33 se derivó de más de una docena de líneas informadoras transcripcionales T1. El análisis de expresión por qPCR se realizó una vez con cuatro repeticiones técnicas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos complementarios que respaldan este estudio se enviaron a Dryad y se pueden encontrar utilizando este enlace: https://doi.org/10.5061/dryad.x69p8cznw. Estos conjuntos de datos incluyen los datos numéricos de origen para gráficos y cuadros que se pueden encontrar en el archivo de Excel, imágenes confocales originales en formatos lif y lsm, y alineaciones de genes en formato fas. Todos los datos adicionales están disponibles del autor correspondiente a petición razonable.

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Agradecemos al Dr. Bojan Gujas por compartir la línea transgénica (pCVP2:NLS-Venus) y el asesoramiento técnico para la microscopía de floema. Agradecemos al Bioimage Core Facility de la Universidad de Friburgo y al Adolphe Merkel Imaging Facility. Este trabajo fue financiado por Ambizione SNSF Grant (PZ00P3_179745) a OH, COST SNSF Grant (IZCOZ0_189892) a OH y financiamiento adicional proporcionado por la Universidad de Friburgo a OH

Departamento de Biología, Universidad de Friburgo, Chemin du Musee 10, 1700, Friburgo, Suiza

Samy Carbonnel, Salves Cornelis y Ora Hazak

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Cicatriz. y la investigación diseñada por OH; Cicatriz. y S.Cor. investigación realizada; S.Car analizó los datos y preparó cifras; OH escribió el primer borrador; OH, S.Car., y S.Cor. juntos editaron el manuscrito; proyecto supervisado OH; OH adquirió financiación.

Correspondencia a Ora Hazak.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: David Favero.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Carbonnel, S., Cornelis, S. y Hazak, O. El péptido CLE33 reprime la diferenciación del floema a través de la señalización autocrina y paracrina en Arabidopsis. Commun Biol 6, 588 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04972-2

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Recibido: 13 Abril 2023

Aceptado: 23 de mayo de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04972-2

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