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May 16, 2023

Potencial del sistema CRISPR/Cas como herramientas emergentes en la detección de infección por hepatitis viral

Revista de virología

Virology Journal volumen 20, Número de artículo: 91 (2023) Citar este artículo

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La hepatitis viral, la causa más común de enfermedad hepática inflamatoria, afecta a cientos de millones de personas en todo el mundo. Se asocia más comúnmente con uno de los cinco virus nominales de la hepatitis (virus de la hepatitis A-E). El VHB y el VHC pueden causar infecciones agudas e infecciones crónicas persistentes de por vida, mientras que el VHA y el VHE causan infecciones agudas autolimitadas. HAV y HEV se transmiten predominantemente a través de la ruta fecal-oral, mientras que las enfermedades transmitidas por las otras formas son enfermedades transmitidas por la sangre. A pesar del éxito en el tratamiento de la hepatitis viral y el desarrollo de vacunas contra el VHA y el VHB, aún no existe un diagnóstico preciso a nivel genético para estas enfermedades. El diagnóstico oportuno de la hepatitis viral es un requisito previo para una intervención terapéutica eficaz. Debido a la especificidad y sensibilidad de la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/secuencias asociadas a CRISPR (Cas), tiene el potencial de satisfacer necesidades críticas en el campo del diagnóstico de enfermedades virales y se puede utilizar en puntos versátiles. aplicaciones de diagnóstico de atención (POC) para detectar virus con genomas de ADN y ARN. En esta revisión, discutimos los avances recientes en las herramientas de diagnóstico CRISPR-Cas y evaluamos su potencial y perspectivas en estrategias rápidas y efectivas para el diagnóstico y control de la infección por hepatitis viral.

La hepatitis viral, una infección que causa inflamación del hígado, es un importante problema mundial de atención de la salud. Se sabe que existen numerosos virus que causan inflamación del hígado, incluidos el virus del herpes simple (HSV), el citomegalovirus (CMV), el virus de Epstein-Barr (EBV) y el virus de la varicela-zoster (VZV) [1]. Sin embargo, los agentes causales más frecuentes de esta afección son los virus hepatotrópicos, incluidos el virus de la hepatitis A (VHA), el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis delta (VHD) y el virus de la hepatitis E (VHE). ), que conducen a una infección aguda o crónica [2]. Estos virus del hígado incluyen una variedad de virus de ADN y ARN de diferentes familias virales que se propagan a través de diferentes vías de transmisión [3]. A nivel mundial, la hepatitis viral causa alrededor de 1,4 millones de muertes cada año. En términos de mortalidad, el VHB y el VHC se encuentran entre las cuatro principales amenazas infecciosas del mundo, al mismo nivel que el VIH, la malaria y la tuberculosis [4, 5]. Los síntomas clínicos de la hepatitis viral varían desde síntomas como hepatitis asintomática hasta hepatitis aguda, insuficiencia hepática aguda, enfermedad hepática crónica e incluso el desarrollo de resultados relacionados con el hígado, incluido el carcinoma hepatocelular (CHC) en diferentes pacientes [6]. A pesar de algunos avances médicos en la terapia de la hepatitis y el desarrollo de vacunas contra el VHA y el VHB, todavía existe una gran brecha en el diagnóstico genético preciso de las infecciones por hepatitis viral. El diagnóstico temprano y preciso de la hepatitis viral y la evaluación temprana de su pronóstico son fundamentales para el tratamiento y la atención efectivos de las personas afectadas [7]. La tecnología emergente de edición de genes, CRISPR/Cas, tiene el potencial de llenar estos vacíos técnicos. El sistema CRISPR/Cas es atractivo para una amplia gama de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas con alta eficiencia y diseños programables [8]. Los loci CRISPR se descubrieron por primera vez en E. coli en 1987, seguido de la identificación de proteínas dependientes de CRISPR. Investigaciones posteriores han demostrado que CRISPR sirve como mecanismo de defensa en células procariotas contra elementos genéticos exógenos, incluidos patógenos virales y plásmidos, mediante la degradación precisa y específica de sus secuencias [9, 10]. El sistema CRISPR-Cas se divide en dos categorías principales, Clase I y Clase II, que incluyen seis tipos y cuarenta y ocho subtipos [11]. La clase I incluye los tipos I, III y IV, que están asociados con las enzimas Cas3, Cas10 y Cas8-like (csf1), respectivamente, y utilizan CRISPR RNA (crRNA) junto con un conjunto de proteínas Cas para identificar y eliminar el elementos genéticos diana. La clase II del sistema CRISPR incluye los tipos II, V y VI, que contienen proteínas Cas9, Cas12 y Cas13, respectivamente, y utiliza crRNA y solo una proteína Cas multidominio para su función [12,13,14,15, dieciséis]. En esta revisión, exploramos los avances recientes en las herramientas de diagnóstico CRISPR-Cas y sus posibles aplicaciones en la detección de infecciones por hepatitis viral. En primer lugar, repasamos brevemente las cinco clasificaciones principales de los virus de la hepatitis y sus aspectos clínicos. En las siguientes secciones, describimos la importancia y las aplicaciones del sistema CRISPR-Cas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, centrándonos principalmente en diferentes efectores CRISPR-Cas para la detección de hepatitis viral. También proporcionaremos una explicación detallada de los pros y los contras de los sistemas de diagnóstico basados ​​en CRISPR y presentaremos futuras perspectivas de investigación.

La hepatitis viral es una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad humana, tanto por infección aguda como por complicación crónica [17, 18]. Aunque los cinco virus de la hepatitis infectan principalmente el hígado, se clasifican en diferentes familias virales y son completamente diferentes entre sí en términos de estructura, genoma y ciclo de vida [19]. HAV y HEV generalmente se transmiten de persona a persona a través de la vía fecal-oral, mientras que HBV, HCV y HDV se transmiten a través de la exposición a la sangre y los fluidos corporales de una persona infectada [19]. La enfermedad de la hepatitis viral a menudo ocurre sin ningún síntoma. Sin embargo, la hepatitis crónica puede evolucionar hacia ictericia, anorexia, fibrosis y eventualmente cirrosis y cáncer de hígado. Las personas con hepatitis inicialmente experimentan síntomas similares a los de la gripe, similares a muchas otras infecciones virales agudas. Otros síntomas posibles incluyen fatiga, fiebre, dolor en las articulaciones y los músculos, ictericia (coloración amarillenta de los ojos y la piel), así como dolor abdominal. En la mayoría de los casos, la respuesta inmune del huésped es capaz de eliminar el virus. Sin embargo, esta tasa varía desde el 100 % de eliminación en casos de VHA hasta solo el 20-30 % de eliminación en casos agudos de VHC. Cuando las infecciones por VHB y VHC persisten hasta por 6 meses, pueden definirse como hepatitis crónica B y C, respectivamente. Cada hepatitis viral se diagnostica mediante el historial del paciente, un examen físico, pruebas de función hepática, pruebas serológicas de anticuerpos y una prueba basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el ácido nucleico viral (ARN o ADN). Los seres humanos son los únicos huéspedes conocidos de los virus de la hepatitis, a excepción del VHE, que puede tener un reservorio en los animales domésticos [20].

El VHA se identificó por primera vez en 1973. Es un virus de ARN monocatenario, icosaédrico y sin envoltura que pertenece a la familia de los picornavirus. En la actualidad, el VHA se puede dividir en tres genotipos, incluidos I, II, III, con dos subtipos que incluyen los subtipos A y B, que pueden infectar a los humanos. Generalmente se transmite por vía fecal-oral, ya sea por contacto de persona a persona y por comer o beber agua o alimentos contaminados. El VHA es endémico en muchos países, especialmente en países con recursos sanitarios limitados [21]. La prevalencia de la infección por VHA es baja en los países desarrollados. La seroprevalencia de anticuerpos anti-VHA en los Estados Unidos es de aproximadamente 10% en niños y 37% en adultos. Más del 50% de los casos en los países desarrollados son el resultado de la infección por viajes a países endémicos [22]. El VHA puede causar una infección aguda que suele ser autolimitada y no conduce a una infección crónica ni a una enfermedad hepática crónica. El período de incubación del VHA es de 15 a 50 días (28 días) desde la exposición. Las personas con enfermedades crónicas subyacentes tienen un mayor riesgo de desarrollar insuficiencia hepática aguda debido a la infección por VHA. Las tasas de letalidad se estiman del 0,3 al 0,6% para todas las edades y aumenta al 1,8% en pacientes mayores de 49 años [23]. La propagación del VHA en el hígado se produce a través de la vena porta (el vaso sanguíneo que lleva sangre al hígado desde los intestinos) después de que el virus atraviesa la mucosa de la pared del intestino delgado. Posteriormente, los virus se replican en los hepatocitos antes de la excreción, nuevamente a través de la bilis a través de las heces [24]. La hepatitis A aguda se diagnostica principalmente por la presencia de anticuerpos de inmunoglobulina M contra el VHA (IgM anti-VHA). Anti-HAV IgM se vuelve detectable unos días antes o simultáneamente con el inicio de los síntomas. Los niveles séricos de IgM aumentan durante la infección aguda y permanecen positivos durante un promedio de 4 meses después del inicio de los síntomas. IgG anti-HAV aparece temprano en el curso de la infección y es detectable durante muchos años, lo que confiere inmunidad de por vida. Aunque las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT, como PCR) son más sensibles que la prueba de inmunoensayo para la detección de HAV, rara vez se usan para este propósito. La secuenciación y el análisis filogenético se utilizan principalmente para rastrear brotes y estas técnicas son particularmente útiles para identificar rutas de transmisión [24, 25]. Las vacunas actualmente disponibles para el VHA son seguras y altamente efectivas y se incluyen en los programas de inmunización infantil de rutina en diferentes países [26]. El calendario de vacunación estándar para la vacuna inactivada contra el VHA consta de dos dosis administradas con al menos 6 meses de diferencia. Se ha demostrado que este programa de vacunación es altamente protector y se espera que dure muchos años [27].

El VHB es un miembro prototipo de la familia Hepadnaviridae. Es un virus envuelto que contiene ADN de doble cadena parcial, circular y relajado [28]. Aunque el VHB es un virus de ADN, la replicación se produce a través de la transcripción inversa del ARN pregenómico (ARNpg) [29]. Actualmente, el VHB se clasifica en 10 genotipos, incluidos los genotipos A a J, según las diferencias en la secuencia del genoma, con 35 subgenotipos. La distribución de los genotipos varía ampliamente en todo el mundo [30]. El VHB es una de las causas comunes de enfermedades hepáticas, incluido el cáncer de hígado, y es altamente contagioso; se transmite a través de la exposición a sangre infectada y otros fluidos corporales (en particular, líquido amniótico, semen y fluidos vaginales) [31, 32]. Es 100 veces más infeccioso que el VIH y 10 veces más que el VHC [22]. La prevalencia de la infección por VHB varía en diferentes regiones del mundo, desde el 0,7 % de la población adulta en áreas de baja endemia, como América del Norte, Europa occidental y partes de América del Sur, hasta el 6,2 % en áreas de alta endemia, como África. , Sudeste Asiático y China [30]. La prevalencia general del VHB crónico en los EE. UU. fue de alrededor del 3/5% [33]. La infección por VHB puede provocar una enfermedad tanto aguda (a corto plazo) como crónica (a largo plazo). La infección aguda por VHB puede ser asintomática o sintomática. La mayoría de los adultos infectados se recuperan, incluso si sus signos y síntomas son graves, pero entre el 5 y el 10 % de los adultos infectados desarrollan una infección crónica, lo que puede provocar cirrosis y cáncer de hígado [34]. El VHB tiene un tropismo específico por las células hepáticas a las que se adhiere y fusiona durante la infección primaria. El VHB se internaliza en los hepatocitos por endocitosis después de unirse a su receptor de alta afinidad, el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (NTCP). Luego, la cápside del virus se liberó en el citoplasma y se translocó al poro nuclear a través de la red de microtúbulos. En el poro nuclear, el ADNrc se libera en el núcleo, donde se convierte en ADN circular cerrado covalentemente (cccDNA). En este paso, el cccDNA se cromatiniza y sirve como molde transcripcional para todos los ARN pregenómicos del VHB. En el citoplasma, el pgRNA se encapsida y retrotranscribe en rcDNA. Las cápsides se envuelven y se secretan como nuevos viriones de la célula, o se transportan de vuelta al núcleo para amplificar la reserva de cccDNA [35]. Varias proteínas diferentes codificadas por el ADN del VHB juegan un papel esencial en la persistencia viral y la patogénesis hepática, incluidas dos proteínas centrales, un antígeno central particulado (HBcAg) y un antígeno secretado (HBeAg), antígeno de superficie (HBsAg), HBx y polimerasa y todos que juegan un papel en su diagnóstico y vigilancia [24, 36]. Después de la infección, el ADN del VHB y el HBsAg pueden detectarse en el suero de una persona infectada en 1 a 2 semanas. Seis a ocho semanas más tarde, IgM anti-HBc y HBeAg se vuelven detectables. En los casos de infección aguda por VHB, HBsAg y HBeAg desaparecen en 4 a 6 meses. A la desaparición del HBsAg le sigue la aparición del Anticuerpo contra el HBsAg (Anti-HBs). El intervalo entre la desaparición del HBsAg del suero y la aparición de anti-HBs en el mismo se conoce como fase ventana y puede durar hasta 6 meses [22]. Por lo tanto, el paso inicial del diagnóstico del VHB se realiza mediante una prueba serológica para detectar el HBsAg y otros antígenos y anticuerpos del VHB. Se utilizan más pruebas moleculares para la detección cuantitativa y cualitativa para verificar el primer paso del diagnóstico (Tabla 1) [37]. La reactivación del VHB se refiere a un aumento repentino en la replicación del VHB en un paciente con VHB crónico o previo. Aunque la reactivación del VHB (VHBr) puede ocurrir espontáneamente, es más comúnmente inducida por la terapia con medicamentos inmunosupresores (ISDT) para el cáncer, las enfermedades inmunológicas o el trasplante [38]. La vacunación es una estrategia altamente eficaz para la prevención de la infección por VHB. Una serie de vacunación de tres dosis de vacunas contra la hepatitis B (recombinantes), compuestas de HBsAg, da como resultado un nivel protector de títulos anti-HBs en > 90 % de las personas sanas [39].

El VHC, miembro de la familia Flaviviridae, tiene un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo que codifica tres proteínas estructurales y siete no estructurales. La alta tasa de mutación del VHC conduce a una marcada heterogeneidad genómica. El VHC se clasifica en siete genotipos confirmados y al menos 67 subtipos confirmados. Mientras tanto, los genotipos 1 a 3 se distribuyen globalmente, mientras que los genotipos 4 a 6 se concentran en un área determinada. El genotipo 4 y el subtipo 5a del VHC son endémicos en Oriente Medio y el norte de Sudáfrica, respectivamente. Los genotipos 6 y 7 del VHC se observan principalmente en el sudeste asiático y la República Democrática del Congo, respectivamente [24, 40]. Las principales formas de transmisión del VHC son a través de la vía sanguínea, como el uso de drogas por vía intravenosa e intranasal, la contaminación de las inyecciones de medicamentos y el contacto sexual [41]. Se estima que la prevalencia mundial del VHC es del 1,5 al 2,3 % en las áreas más afectadas y del 0,5 al 1,0 % en otras áreas [42]. La prevalencia del VHC en usuarios de drogas inyectables está entre el 50 y el 90%, que es el grupo más grande entre las personas infectadas [43]. El VHC puede causar infecciones agudas con una alta tendencia a la enfermedad crónica. El VHC crónico puede provocar una enfermedad hepática grave, incluida la cirrosis y el riesgo de CHC [44]. El receptor Scavenger clase B tipo I (SCARB1), oclusivo (OCLN), Claudin-I (CLDN1) y el grupo de diferenciación 81 (CD81) son los principales factores del huésped que facilitan la unión y la absorción del VHC en los hepatocitos. Además, CD81 interactúa con la partícula viral a través de la glicoproteína E2 de la envoltura viral u otras moléculas, lo que facilita la entrada de la partícula viral en el hepatocito [45]. El diagnóstico virológico del VHC se establece mediante dos categorías de pruebas de laboratorio, incluidas las pruebas indirectas, en las que se realizan ensayos serológicos para detectar un anticuerpo específico del VHC (anti-VHC) en el paciente infectado, y las pruebas directas, en las que la detección, cuantificación , o se puede realizar la caracterización de los componentes de las partículas virales del VHC, como el ARN del VHC y el antígeno central. La sensibilidad y especificidad de los inmunoensayos enzimáticos (EIA) de tercera generación para detectar anticuerpos contra diferentes antígenos de la partícula viral del VHC es del 99% después de 2 a 6 meses después de la exposición al virus. Uno de los métodos de ensayo directos es el uso de PCR en tiempo real para la detección cuantitativa o cualitativa del ARN del VHC, que puede detectar partículas del VHC en pacientes con al menos 10–15 UI/mL (Tabla 2) [46].

HDV, un miembro del género Deltavirus, es un virus de ARN de sentido negativo monocatenario, circular y envuelto que codifica dos tipos de proteínas; la proteína pequeña (S-HDAg) y la proteína grande (L-HDAg), que tienen un tamaño de 24 kDa y 27 kDa, respectivamente. Se requiere S-HDAg para la replicación del ARN viral, mientras que L-HDAg es esencial para el ensamblaje viral [47]. HDV se considera un virus satélite porque requiere la asistencia de proteínas de superficie de HBV (HBsAg) para generar partículas de virión maduras. Como resultado, se pueden establecer dos patrones distintos de infección por HDV; ya sea coinfección por VHB/VHD o sobreinfección por VHD. La coinfección por HBV/HDV ocurre cuando una persona se infecta simultáneamente con HBV y HDV, mientras que la superinfección por HDV ocurre cuando una persona que ya tiene una infección crónica por HBV adquiere HDV. El desarrollo de una sobreinfección crónica por VHD puede exacerbar la lesión hepática causada por el VHB, y se ha demostrado que tanto la coinfección como la sobreinfección tienen resultados más graves que la infección por VHB sola, incluida la hepatitis fulminante, el CHC y la hepatitis crónica [48]. Actualmente, se han identificado tres genotipos de HDV (Genotipo I-III), entre ellos predomina el Genotipo I [22]. Al igual que el VHB y el VHC, el VHD se transmite principalmente por vía sexual, así como a través de la exposición a sangre y productos sanguíneos infectados [28]. A nivel mundial, se estima que alrededor del 5% al ​​10% de los pacientes con hepatitis B crónica (HCB) están coinfectados con el VHD, con una prevalencia más alta en las poblaciones de drogas inyectables. Las áreas con una alta prevalencia de infección por HDV incluyen la cuenca del Mediterráneo, América del Sur, Mongolia y Sudán. En América del Norte y el norte de Europa, la prevalencia es baja y se limita principalmente a los usuarios de drogas inyectables [22, 49]. El primer paso en el diagnóstico de la infección por HDV es analizar a las personas con HBsAg positivo para detectar los anticuerpos totales específicos contra HDV (IgG e IgM combinados) en el suero. Para los pacientes positivos para anticuerpos anti-HDV, el siguiente paso es analizar el ARN del HDV en suero para determinar si el anticuerpo representa una infección por el HDV activa en curso (positivo para el ARN del HDV) o solo representa una cicatriz serológica (negativo para el ARN del HDV) [ 50].

El VHE se descubrió por primera vez en 1983 cuando los científicos buscaban la causa del brote de hepatitis no A, no B (NANB), que se transmite por vía entérica [51]. HEV pertenece al género Hepevirus de la familia Hepeviridae. [52, 53]. Se han reconocido tres grupos de mamíferos Hepeviridae en base a la secuenciación completa del genoma de cepas humanas y animales. La primera categoría consiste en virus que afectan a personas, cerdos, ciervos y conejos. Los 24 subgenotipos de los cuatro genotipos humanos de VHE (genotipos 1-4) identificados de pacientes infectados se incluyen en este grupo [53]. El HEV se transmite con mayor frecuencia a través de la contaminación del agua y los alimentos, y con menos frecuencia a través de la vía zoonótica o mediante transfusiones de sangre [52]. Los genotipos 1–4 de HEV muestran una distribución geográfica seleccionada. Los genotipos 1 y 2 son las principales causas de infecciones agudas por VHE en áreas endémicas del sur de Asia y el África subsahariana [54]. El genotipo 3 es el genotipo más común asociado con la infección por VHE en Europa y América [55]. El genotipo 4 del HEV se identificó inicialmente solo en Asia, pero otros informes también identificaron este genotipo en cerdos y humanos en Europa [52]. Los genotipos 1 y 2 del VHE son patógenos humanos obligados y se transmiten principalmente a través del agua potable contaminada en áreas con saneamiento deficiente, mientras que los genotipos 3 y 4 son zoonóticos y se transmiten principalmente a través del consumo de carne cruda o poco cocida o productos del hígado de su huésped principal (es decir, , cerdo, jabalí y ciervo) [56]. La infección por HEV generalmente es autolimitada y causa hepatitis aguda. La infección por VHE tiene un período de incubación de 15 a 60 días. El HEV agudo típico puede conducir a una elevación de las aminotransferasas más de 10 veces de lo normal. Los principales síntomas clínicos descritos son anorexia, náuseas, malestar general y dolor abdominal, además de artralgias, diarrea, prurito y exantema. Dentro de 1 a 6 semanas después de las infecciones, las aminotransferasas vuelven a la normalidad. La tasa de letalidad es de aproximadamente 0,5 a 3% en individuos adultos. HEV también puede causar insuficiencia hepática fulminante (FHF, por sus siglas en inglés), en la cual se desarrolla encefalopatía dentro de los días o semanas posteriores al inicio de los síntomas. FHF parece ocurrir más comúnmente en mujeres embarazadas, por lo tanto, HEV tiene una mayor letalidad en mujeres embarazadas [22]. Tanto las pruebas serológicas como las pruebas basadas en ácidos nucleicos se han desarrollado para el diagnóstico de HEV con fines epidemiológicos y de diagnóstico. El ensayo serológico para la infección por VHE generalmente depende de la detección de IgG anti-VHE y de IgM anti-VHE. Los anticuerpos IgM anti-VHE suelen ser detectables en la fase aguda de la enfermedad y su presencia en el suero dura aproximadamente 4 o 5 meses, lo que indica una exposición reciente, mientras que los anticuerpos IgG anti-VHE pueden persistir más de 10 años, lo que indica una exposición previa. Por lo tanto, el diagnóstico de infección aguda por VHE se basa en la presencia de IgM anti-VHE, mientras que la prueba diagnóstica de IgG anti-VHE es una buena opción para investigaciones epidemiológicas [57]. Sin embargo, la detección y cuantificación de HEV-RNA por PCR es un enfoque estándar de oro para el diagnóstico de infección aguda y crónica por HEV [58]. Actualmente, no hay vacunas específicas, excepto la autorizada en China, ni opciones terapéuticas disponibles para el VHE [22].

Como agentes infecciosos de potencialmente todos los tipos de células vivas, los virus son las entidades biológicas más abundantes en el medio ambiente, que pueden causar una epidemia que amenaza la vida y la salud de humanos y animales y causa pérdidas económicas significativas. La aparición de un brote grave a menudo conduce a pérdidas o daños irreversibles, por lo que un diagnóstico temprano y rápido de la infección viral es particularmente importante [59]. Las técnicas tradicionales para el diagnóstico de laboratorio de infecciones virales generalmente se pueden dividir en 3 categorías que incluyen (1) detección directa de viriones en material del paciente, antígenos virales o ácidos nucleicos virales, (2) aislamiento del virus en células cultivadas, seguido de la identificación del aislado (examen indirecto) y (3) diagnóstico serológico que se basa en la detección y medición de anticuerpos en el suero del paciente [60]. La mejor herramienta de diagnóstico viral debe satisfacer los siguientes criterios de requisitos: velocidad, simplicidad, sensibilidad, especificidad y costo. Prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT), que incluye PCR, PCR en tiempo real, RT-PCR, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) y amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), y métodos basados ​​en la detección de complejos antígeno-anticuerpo como como los inmunoensayos enzimáticos de fase sólida (EIA) y la tecnología de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), en particular, han revolucionado la virología diagnóstica y ahora se usan ampliamente para detectar diferentes virus [61, 62]. Actualmente, las NAAT se describen como un método "estándar de oro" para el diagnóstico de infecciones virales debido a su alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, las técnicas de diagnóstico viral basadas en PCR están limitadas por el alto costo de los reactivos e instrumentos, así como por la ardua operación técnica. El método analítico de nueva generación basado en la escisión inespecífica de ADN y ARN observada en los sistemas CRISPR-Cas proporciona avances prometedores en el diagnóstico basado en CRISPR de infecciones emergentes debido a su alta especificidad, versatilidad y ciclo de detección rápido [62, 63].

Los descubrimientos clave de que las células procariotas, como las bacterias y las arqueas, tienen inmunidad adaptativa hereditaria contra elementos genéticos extraños mediados por CRISPR y proteínas asociadas a CRISPR (Cas) han llevado a avances transformadores en biología molecular [64]. Las células procariotas almacenan estos elementos genéticos de agentes infecciosos como bacteriófagos, plásmidos o transposones en locus genómicos llamados matrices CRISPR, lo que permite que la célula recuerde, reconozca y elimine infecciones. Las proteínas cas facilitan la inmunidad adaptativa a través del proceso de varios pasos que comprende la adaptación, la biogénesis del ARN CRISPR (ARNcr) y la interferencia. Durante la adaptación, que es la primera etapa de la inmunidad CRISPR, los elementos genéticos extraños se reconocen, procesan y seleccionan para integrarlos en la matriz CRISPR, lo que proporciona un elemento de recuperación durante la infección recurrente. Durante la etapa de expresión, también conocida como biogénesis de crRNA, la matriz CRISPR se transcribe en un precursor largo (pre-crRNA) y se procesa en forma madura como crRNA. En la última etapa, los crRNA maduros guían a las proteínas Cas para escindir secuencias complementarias de ADN extraño (interferencia) y eliminar esos elementos. Al descubrir los componentes estructurales y funcionales de estos diversos sistemas, están surgiendo nuevas herramientas, incluidas las aplicables al diagnóstico molecular [65].

Desde el descubrimiento inicial de los sistemas CRISPR-Cas, sus diversas variantes se han expandido rápidamente. Actualmente, los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases, seis tipos y varios subtipos en función de las relaciones evolutivas. Dependiendo de la naturaleza de los complejos efectores de ribonucleoproteína, se han definido dos clases principales de sistemas CRISPR-Cas; Clase 1 (incluye los tipos I, III y IV) y clase 2 (incluye los tipos II, V y VI). Los sistemas de clase 1 se caracterizan por un complejo de múltiples proteínas efectoras, y los sistemas de clase 2 abarcan una sola proteína de unión a crRNA [11]. La mayoría de los sistemas CRISPR-Cas identificados (alrededor del 90 %) pertenecen a sistemas de clase 1 [16]. Entre los diversos sistemas CRISPR, los sistemas de clase 2 se han aplicado principalmente para el diagnóstico, ya que estos sistemas son más sencillos de reconstituir. Incluyen enzimas con actividad colateral, que sirve como la columna vertebral de muchos ensayos de diagnóstico basados ​​en CRISPR. Cas9, Cas12 y Cas13 tienen un gran impacto en la clasificación CRISPR-Cas para tipo II, tipo V y tipo VI como nucleasas efectoras únicas, respectivamente. La última clasificación de los sistemas CRISPR-Cas atribuye el mayor número de subgrupos al sistema tipo V con 17 subgrupos derivados [11]. Los sistemas de clase 1 (como la nucleasa efectora de tipo III Csm6 o Cas10) también se han diseñado para el diagnóstico, ya sea en combinación con componentes del sistema de clase 2 o con el complejo nativo de tipo III) [66]. Un dominio de nucleasa similar a RuvC en el sistema Cas12 cataliza la escisión de un objetivo dsDNA por los sistemas Tipo V [67]. Esta característica ha llevado al uso de Cas12a, también conocido como Cpf1, en las pruebas de diagnóstico de patógenos virales [68, 69]. El sistema CRISPR-Cas tipo VI tiene cinco variantes de subtipo. Cas13a en el subtipo VI-A se conoce como ARNa guiada por ARN [16]. Cas13a es capaz de unirse a crRNA y así formar un complejo que eventualmente escinde ssRNA [12]. La capacidad de Cas13a en ssRNA se escinde ha llevado al desarrollo de plataformas modernas para la detección rápida y sensible de enfermedades infecciosas. Cada una de las plataformas de diagnóstico de infecciones virales basadas en Cas12a y Cas13a se analiza en la siguiente sección (Fig. 1) [70, 71].

Clasificación de las clases del sistema CRISPR-Cas en función de sus proteínas efectoras

Debido a la naturaleza programable de los sistemas CRISPR-Cas, se han explotado en muchos campos diferentes de la biología y la medicina y, de hecho, han revolucionado estos campos. Un número creciente de estudios ha demostrado que la tecnología CRISPR/Cas puede integrarse con biosensores y bioensayos para diagnóstico molecular. Los diagnósticos basados ​​en CRISPR han atraído mucha atención como sensores altamente específicos y sensibles con capacidades fácilmente programables e independientes del dispositivo. Esta técnica se ha utilizado para la detección de biomarcadores basados ​​en ácidos nucleicos de enfermedades infecciosas y no infecciosas y para la detección de mutaciones y deleciones indicativas de enfermedades genéticas. Con más investigación, es prometedor para detectar otros biomarcadores, como moléculas pequeñas y proteínas [66, 72]. En esta sección describimos brevemente la aplicación de los sistemas CRISPR/Cas en el campo del diagnóstico.

El objetivo principal de los enfoques de diagnóstico basados ​​en CRISPR es la identificación de patógenos específicos, como virus, bacterias y parásitos de ADN o ARN. Los virus de ARN que se detectaron con un enfoque basado en CRISPR incluyen el parvovirus B19, el virus Zika (ZIKV), el virus del dengue (DENV), el virus de la encefalitis japonesa, el virus del Ébola (EBOV) y el virus Corona. Además de los virus de ARN, los virus de ADN como el citomegalovirus (CMV), el virus de Epstein-Barr, el virus BK (BKV) y el virus del papiloma humano (VPH) también se han detectado con diagnósticos basados ​​en CRISPR [73]. El sistema CRISPR/Cas también se ha utilizado para la detección de varias bacterias patógenas como Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella enteritidis [74]. Además, la técnica de CRISPR/Cas se ha aplicado con éxito para la detección ultrasensible del parásito Plasmodium responsable de la malaria [75].

También se han implementado tecnologías de diagnóstico basadas en CRISPR-Cas para la detección de material genético relevante para enfermedades no infecciosas. Por ejemplo, este sistema se usó para detectar niveles anormales de ARNm de CXCL9 humano, un indicador de rechazo agudo de trasplante de riñón celular, con el fin de detectar la enfermedad de injerto contra huésped en trasplantes de riñón [76]. Además de los ARNm, el sistema de diagnóstico basado en CRISPR también se ha utilizado para detectar miARN específicos, como miR-19b en el suero de pacientes con meduloblastoma [77] y miR-17 aislado de líneas celulares de cáncer de mama [78].

Una fortaleza clave de los diagnósticos basados ​​en CRISPR es la especificidad de un solo nucleótido de las enzimas Cas, que permite la discriminación de mutaciones puntuales (SNP) y pequeñas deleciones. La especificidad de un solo nucleótido de la detección basada en CRISPR ha hecho posible que este sistema detecte marcadores de resistencia antimicrobiana, deleciones y mutaciones en el gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y BRAF [79], mutaciones que confieren distrofia muscular de Duchenne [80 ] y SNP en el gen de la ubiquitina ligasa E3 que confiere el color de ojos. El potencial de especificidad del sistema CRISPR-Cas también se ha aprovechado para la detección de miARN, que son difíciles de diagnosticar debido a su pequeño tamaño y porque pueden diferir en una sola base [66].

El diagnóstico preciso, sensible y rápido de las infecciones virales es el primer paso crítico hacia el tratamiento preciso y oportuno de las infecciones virales. El diagnóstico de patógenos basado en CRISPR-Cas ha ganado una enorme popularidad en los últimos años, principalmente debido a la alta especificidad, sensibilidad y rápido diagnóstico de este sistema [81]. Se han introducido numerosas variaciones y avances en la plataforma basada en CRISPR, contando con la actividad colateral de las proteínas CRISPR-Cas tipo V y tipo VI, pero la concepción general permanece sin cambios. A continuación, describimos las diversas plataformas basadas en las nucleasas Cas9, Cas12 o Cas13 asociadas a CRISPR que se utilizan para el diagnóstico de diferentes infecciones virales.

En 2016, Pardee et al. introdujo el primer método de diagnóstico basado en CRISPR/Cas capaz de reconocer dsDNA. Desarrollaron un método de diagnóstico rápido y económico para detectar el virus del Zika mediante CRISPR tipo II, llamado amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos-división CRISPR (NASBACC). El sistema NASBACC consta de tres partes: amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos para la preamplificación isotérmica de objetivos, reconocimiento de ADN objetivo dependiente del motivo adyacente del protoespaciador (PAM) por parte de Cas9 y un detector toehold para la lectura. Brevemente, un interruptor toehold activado se une a un fragmento de ARN amplificado por NASBA a través de la transcripción inversa. Si la secuencia PAM está disponible en el fragmento de ARN, la escisión mediada por Cas9 provoca un ARN corto sin la secuencia desencadenante. En ausencia de la secuencia PAM, el disparador que contiene el ARN de longitud completa activa el interruptor de punto de apoyo, indicado por un cambio de color [82]. Sin embargo, en el mismo año en que se descubrió la actividad de escisión colateral de Cas13a, este campo se revolucionó. La actividad colateral exige la escisión de ARN monocatenario no dirigido (ssRNA; Cas13) y ADN monocatenario (ssDNA; Cas12) en una solución, lo que permite la detección de ácidos nucleicos a través de la amplificación de la señal y potencia múltiples lecturas mediante la adición de funcionalizados. ácidos nucleicos informadores. En estudios recientes, se han desarrollado varios métodos basados ​​en CRISPR, como las técnicas CRISPR Trans Reporter (DETECTR) y Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK), que utilizan enzimas tipo V CRISPR-CAS12a y tipo VI Cas13a. , respectivamente. El sistema SHERLOCK usa la endonucleasa Cas13 para degradar las cadenas de ARN y el sistema DETECTR usa la proteína Cas12a para hacer lo mismo con el ADN [16, 68].

La primera plataforma aplicable basada en el sistema CRISPR-Cas tipo VI (Cas13), SHERLOCK, fue desarrollada en 2017 por Zhang Lab basándose en la actividad de la nucleasa Cas13 de Leptotrichia wadei [16]. El sistema SHERLOCK CRISPR-Cas se refiere a la detección de ácidos nucleicos novedosos utilizando nucleasas Cas13 o Cas12 combinadas con un paso de preamplificación isotérmica para aumentar la cantidad de ADN o ARN que exhibe altos niveles de actividad de ARNasa colateral al reconocer una secuencia objetivo específica. El sistema SHERLOCK consta de tres pasos básicos: (1) El primer paso es la preamplificación isotérmica, que genera múltiples copias de una plantilla de ARN o ADN utilizando cebadores específicos. (2) A continuación, el cebador directo que contiene un promotor T7 se integra en los amplicones durante la reacción RPA. El promotor T7 permite la transcripción de ARN T7 de dsDNA para convertirlo en amplicones de ssRNA para proporcionar objetivos para Cas13a del complejo Leptotrichia wadeii (LwaCas13-crRNA). El reconocimiento y el apareamiento de bases entre crRNA y la secuencia objetivo activa la actividad colateral de LwaCas13a, lo que conduce a una degradación no específica de secuencia de los indicadores de ARN desactivado adyacentes y (3) en el último paso, la detección de ácido nucleico basada en fluorescencia con LwaCas13a se logra mediante la incorporación de una fluorescencia sonda que emite una señal detectable. Las moléculas reporteras de ssRNA están compuestas por un fluoróforo y un extintor, que están conectados entre sí por un oligómero de ARN corto que, después de la separación, permite la separación del fluoróforo del extintor y, como resultado, emite una señal de fluorescencia que determina la presencia de los virus ARN (Fig. 2). El sistema SHERLOCK es muy sensible y puede detectar un átomomolar (aM o 10–18 M) del objetivo [66, 83].

Métodos SHERLOCK en detección de ácidos nucleicos basados ​​en tecnología CRISPR

Recientemente, se ha desarrollado una segunda versión del sistema SHERLOCK denominada SHERLOCKv2, que tarda unas 2 h en completarse y también aumenta la sensibilidad de detección a dos attomolares [79]. En esta plataforma, la proteína Cas se agrega a la muestra junto con el crRNA (diseñado para unirse específicamente a la secuencia objetivo) y las sondas de ssDNA (como indicadores). Las sondas están unidas a un fluoróforo en un extremo y a un extintor en el otro extremo, y si hay una secuencia diana en la muestra, el crRNA se une a esa secuencia y la actividad colateral de Cas13a se activará y escindirá las sondas. Como resultado, se liberan fluoróforos y un fluorímetro detecta una señal fluorescente fuerte y estable [84]. La superioridad de SHERLOCKv2 sobre SHERLOCK es importante porque toda la reacción de SHERLOCKv2 se realiza en un solo paso al agregar la muestra directamente a la tira reactiva. Además, no se requiere purificación ni separación de ácidos nucleicos en las muestras [85]. Han evolucionado varias plataformas basadas en la proteína Cas13. Myhrvold et al. desarrolló HUDSON (calentamiento de muestras de diagnóstico no extraídas para destruir nucleasas) y lo combinó con SHERLOCK. A través de esta combinación, pudieron detectar directamente los virus del dengue y Zika en los fluidos corporales de los pacientes en concentraciones muy bajas (1 copia por microlitro). La ventaja de esta plataforma es que no hay necesidad de pretratamiento de las muestras [86].

Cas12a es otra enzima Cas con actividad colateral que detecta moléculas de ADN. Una de las primeras plataformas de detección basadas en Cas12a desarrollada en 2018 por Doudna et al. fue DETECTR [86]. En este sistema, la proteína Cas12a de la bacteria Lachnospiraceae (LbCas12a) con actividad colateral no específica es guiada a los objetivos de dsDNA por un crRNA complementario, lo que desencadena la escisión colateral de los reporteros cortos de ssDNA que llevan un fluoróforo y un extintor. De manera similar a SHERLOCK, el reconocimiento de objetivos y la escisión del indicador conducen a la separación del fluoróforo del extintor, que emite una señal de fluorescencia (Fig. 3) [87]. Cas12a tiene una actividad colateral relativamente débil. Por lo tanto, los métodos de diagnóstico basados ​​en Cas12 tienen baja sensibilidad para la detección de ácidos nucleicos. Con la incorrupción de la preamplificación isotérmica por RPA, DETECTR alcanzó una sensibilidad atomolar para la detección de ADN, lo que les permite detectar concentraciones objetivo bajas (concentraciones de 2 aM) [88]. En otras técnicas basadas en Cas12, Li et al. utilizó la actividad colateral de esta enzima y desarrolló una plataforma de detección llamada HOLMES (un sistema de alta eficiencia multipropósito de bajo costo en una hora) para la detección rápida de objetivos de ADN y ARN. La base de HOLMES es similar a la de SHERLOCK en que, en presencia de ADN diana en la muestra, el ARNcr (en complejo con Cas12a) se une a él, se forma un complejo ternario (CAS12a-ARNcr-ADN diana) y la actividad colateral de la enzima Cas se activa y las sondas se degradan [87]. Estas son las plataformas de detección basadas en CRISPR más utilizadas para identificar patógenos; sin embargo, existen otras plataformas, como Cas9-encontrando secuencias de baja abundancia por hibridación (FLASH) y Cas14-DETECTOR, cuya explicación demanda otro trabajo de revisión [89, 90].

Métodos DETECTR en detección de ácidos nucleicos basados ​​en tecnología CRISPR

Hasta ahora, muchos virus de ADN y ARN se han diagnosticado con estos métodos. El sistema SHERLOCK basado en CRISPR-Cas permite la detección del virus Zika, el virus Ébola y el virus Dengue con una sensibilidad de aproximadamente 1 copia por microlitro de muestra. También ha permitido la detección del virus del Nilo Occidental (WNV), el virus de la fiebre amarilla (YFV) y el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Del mismo modo, la tecnología DETECTR también se ha empleado para detectar el SARS-CoV-2. Además, las cepas del virus del papiloma humano (VPH) (VPH-16 y VPH-18) pueden diagnosticarse mediante la tecnología DETECTR. En la siguiente sección, se discute la aplicación potencial de diferentes sistemas CRISPR-Cas en el diagnóstico de hepatitis viral [91].

Alcanzar el objetivo de la Organización Mundial de la Salud de eliminar la hepatitis viral para 2030 requiere un diagnóstico preciso de la enfermedad. Como se mencionó, el ensayo de diagnóstico ideal debe proporcionar una identificación precisa y sensible de los virus, además de ser asequible, portátil y capaz de distinguir diferentes variantes. El desarrollo de nuevas herramientas que cumplan con los requisitos de la prueba de diagnóstico estándar de la OMS puede remodelar por completo los sistemas de vigilancia epidemiológica y de atención médica para las hepatitis virales en el mundo [85]. En este sentido, el sistema CRISPR/Cas emergente puede brindar una oportunidad como una herramienta de diagnóstico de precisión prometedora, especialmente para el ADN del VHB y el ARN del VHC, que son los indicadores más importantes de la hepatitis viral, al apuntar al ADN o ARN viral. En esta sección, revisamos los estudios realizados en el campo de la detección de virus de la hepatitis utilizando diferentes plataformas CRISPR-Cas.

Chen X et al. ideó una plataforma de detección basada en CRISPR-Cas, conocida como "CRISPRHBV", para la detección temprana y ultrasensible de dos genotipos principales del VHB (VHB-B y VHB-C) en aplicaciones clínicas. CRISPR-HBV consta de tres pasos que incluyen amplificación de desplazamiento de cruce múltiple (MCDA) para una preamplificación rápida, detección basada en Cas12b para decodificar objetivos y lectura de resultados con biosensores de flujo lateral y fluorescencia en tiempo real. Este sistema es capaz de detectar 10 copias de ADN genómico por prueba y tiene una especificidad del 100% y tampoco tiene reactividad cruzada en otros genotipos y patógenos del VHB. Todo el proceso de ensayo, que incluye la extracción de la plantilla de ADN, la reacción de preamplificación de MCDA, la detección basada en CRISPR-Cas12b y la lectura de los resultados, puede completarse en 60 minutos y no requiere un equipo costoso. Además, la viabilidad del ensayo CRISPR-HBV para el genotipado de HBV-B y -C se confirmó con éxito mediante la validación con muestras clínicas. Por lo tanto, el sistema CRISPR-HBV tiene el potencial de ser una prueba de diagnóstico POC para la detección y diagnóstico de los genotipos B y C del VHB en aplicaciones clínicas, especialmente en países con recursos médicos insuficientes [92].

Dado que la formación de un reservorio intranuclear de cccDNA en el hepatocito es la principal causa de infección persistente por VHB, Zhang, X et al. desarrolló herramientas de diagnóstico altamente sensibles y específicas para la detección de HBV cccDNA basadas en la tecnología CRISPR-Cas13a. Esta técnica incluye los siguientes pasos: (1) uso de ADNasa dependiente de ATP (PSAD) segura para plásmidos y enzimas HindIII para digerir rcDNA circular y ADN lineal de doble cadena, (2) amplificación de fragmentos específicos de HBV cccDNA usando amplificación de círculo rodante (RCA ) y PCR, y (3) detección de dianas mediante el sistema CRISPR-Cas13a. Este ensayo puede detectar 1 copia/µL cccDNA del VHB mediante lectura de fluorescencia asistida por CRISPR/Cas13. Además, al realizar ddPCR, qPCR, RCA-qPCR, PCR-CRISPR y RCA-PCR-CRISPR, este ensayo se validó para la detección de cccDNA en tejidos hepáticos asociados al VHB, plasma, sangre total y células mononucleares de sangre periférica (PBMC). ) [93].

Muchos estudios revelaron que las mutaciones de resistencia a los medicamentos que ocurren en el genoma del VHB pueden aumentar el riesgo de transmisión del VHB o causar la replicación activa del genoma viral, lo que da como resultado una infección lítica y otros problemas clínicos en los pacientes afectados. Uno de los factores más importantes en la resistencia a los fármacos antivirales es la mutación en el motivo YMDD del gen HBV P. Por lo tanto, Wang S. et al. desarrolló un método altamente sensible y práctico para la detección de mutación de resistencia a fármacos en el ADN del VHB y YMDD basado en el sistema de detección CRISPR-Cas13a y amplificación por PCR, y evaluó su capacidad de diagnóstico utilizando muestras clínicas. Esta técnica representa una sensibilidad muy alta para detectar el VHB e identificar mutaciones de resistencia a fármacos mediante PCR convencional. Dado que la amplificación por PCR es más estable que las técnicas de amplificación isotérmicas, se utilizó la PCR para orientar la amplificación antes de la detección de CRISPR-Cas13a. En términos de sensibilidad, se encontró que esta técnica puede detectar una copia por prueba para mutaciones de resistencia a fármacos en el ADN del VHB y YMDD [94]. En otro estudio, Ding, R et al. desarrolló una prueba POC de VHB rápida y sensible basada en CRISPR-Cas12a acoplado a LAMP. Este ensayo resuelve creativamente el problema de la técnica POC en 10 minutos, especialmente el problema de extracción de muestras de ácido nucleico. Basado en la amplificación isotérmica de bucle (LAMP)-Cas12a, la visualización de los resultados del ensayo se proporciona con tiras reactivas fluorescentes y de flujo lateral. La detección en tiempo real de alta sensibilidad se puede lograr en la lectura de fluorescencia, mientras que los resultados visibles a simple vista se pueden lograr con la tecnología de tiras reactivas de flujo lateral. El ensayo Cas12a basado en lectura fluorescente puede lograr la detección del VHB con una sensibilidad de 1 copia/µl en 13 min, mientras que la técnica de tira reactiva de flujo lateral tarda solo 20 min. La evaluación de muestras clínicas muestra la sensibilidad y especificidad tanto del método de lectura de fluorescencia como de la tira reactiva de flujo lateral al 100 %. Además, los resultados del ensayo fueron completamente comparables con qPCR. La técnica de VHB basada en LAMP-Cas12a se basa en un equipo mínimo y costos bajos para proporcionar resultados de prueba rápidos y precisos, lo que ofrece un potencial práctico significativo para la detección de VHB en POC en regiones médicamente desatendidas (Tabla 3) [95].

La diversidad genética del VHC y las cuasiespecies generadas durante la replicación han provocado resistencia viral a los antivirales de acción directa (DAA), así como obstáculos para el desarrollo de una vacuna. El diagnóstico preciso y oportuno de la enfermedad es un requisito previo para una intervención terapéutica y una vigilancia epidemiológica eficientes [96]. Si bien las técnicas como el inmunoensayo y la qPCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico del VHC, las pruebas POC rápidas y precisas son importantes para identificar a las personas con VHC, particularmente en entornos con recursos limitados donde el acceso o la disponibilidad de las pruebas moleculares aún es limitado. Por lo tanto, para llenar este vacío, existe la necesidad de desarrollar un nuevo ensayo molecular para la detección rápida del ARN del VHC en entornos con recursos limitados [97]. Recientemente, Kham-Kjing et al. desarrolló y evaluó un método rápido y sensible para la detección del ARN del VHC. El método se basó en un sistema CRISPR-Cas12 acoplado con amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) que permite la detección de secuencias genómicas específicas del VHC. Los productos amplificados después de las reacciones de escisión pueden visualizarse en bandas de flujo lateral o medirse con un detector de fluorescencia. Cuando se probó en muestras clínicas de personas infectadas con VHC, VIH o VHB, o de donantes sanos, el ensayo CRISPR-Cas12 combinado con RT-LAMP en comparación con el método de referencia, que fue Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test, mostró 96 % de sensibilidad, 100% de especificidad y 97% de concordancia. Este ensayo fue capaz de detectar concentraciones de ARN del VHC tan bajas como 10 ng/µL. Por lo tanto, esta técnica precisa y específica tiene el potencial de ser una prueba POC confiable y rentable para identificar a las personas con VHC en entornos de bajos recursos (Tabla 3) [98].

Estos estudios generales demostraron el potencial del sistema CRISPR/Cas como una herramienta de diagnóstico eficaz para las infecciones por hepatitis viral. Más allá de estos estudios descritos anteriormente, hasta ahora no se ha desarrollado ningún método de diagnóstico basado en CRISPR para la detección de HAV, HDV y HEV. Sin embargo, la enzima Cas12a es la enzima elegida para desarrollar un método basado en CRISPR para la detección del VHA. Además, dado que el VHD es un virus de ARN, Cas13a es la enzima elegida para el método de diagnóstico del VHD basado en CRISPR. Al igual que el HDV, el HEV es un virus de ARN, por lo que Cas13a es la enzima elegida para el método de diagnóstico basado en CRISPR para la detección de este virus. Incertidumbre, el potencial del sistema CRISPR/Cas puede convertirse pronto en la principal herramienta de diagnóstico para diferentes infecciones de hepatitis virales.

En unos pocos años, el sistema de diagnóstico molecular basado en CRISPR ha pasado de ser una herramienta experimental para la biodetección de ácidos nucleicos a una prueba de diagnóstico clínicamente viable para la detección rápida, asequible, sensible y específica de patógenos, incluidos los virus, en el POC. Aunque esta tecnología presenta muchas ventajas, tiene varios desafíos y limitaciones que debe superar para una aplicación clínica segura y eficiente. Las principales limitaciones de la mayoría de las herramientas de diagnóstico basadas en CRISPR-Cas actuales, incluidas SHERLOCK y DETECTR, es su dependencia de la preamplificación de los ácidos nucleicos objetivo mediante PCR o procesos de amplificación isotérmica (p. ej., PCR, RPA o LAMP). Sin embargo, el proceso de amplificación isotérmica a menudo necesita un conjunto de proteínas como; polimerasa, recombinasa o proteínas de unión y cebadores que incluyen 2 cebadores para RPA y de 4 a 6 cebadores para LAMP y pasos adicionales de preparación de muestras, lo que complica enormemente y alarga el tiempo de ensayo de 20 min a 2 h [99]. Para resolver este problema, en los últimos años se han desarrollado varios métodos de detección sin amplificación, como CRISPR digital, múltiples ARNcr y métodos de transducción de señales altamente sensibles para la detección directa de muestras no amplificadas, que pueden lograr una detección rápida y altamente sensible de virus. Sin embargo, estos métodos también requieren equipos específicos como instrumentos de detección ópticos o fluorescentes de alto costo, chips microfluídicos, etc., lo que limita su amplia aplicación [100]. Se puede predecir que la futura plataforma de tecnología CRISPR/Cas seguirá dependiendo del soporte de otras tecnologías. Por ejemplo, al combinar más técnicas de lectura de señales con nanomateriales, se logrará un rendimiento analítico más simple y sensible para aplicaciones más diversas de las características únicas del sistema CRISPR/Cas.

Además, la facilidad de uso de los diagnósticos basados ​​en CRISPR se mejora a través de reacciones optimizadas en un solo recipiente y una visualización simple de los resultados de las pruebas. Sin embargo, la preparación de la muestra aún requiere un paso separado y las temperaturas de incubación superiores a la temperatura ambiente requieren dispositivos de calentamiento. Además, las concentraciones objetivo cercanas a la concentración de analito (LOD) más baja del ensayo dificultan la cuantificación de la lectura con certeza, especialmente cuando se utiliza un ensayo de flujo lateral. Para uso en el hogar o en el punto de atención (POC), el diseño del ensayo debe combinar protocolos simples de preparación de muestras con métodos de detección sólidos para proporcionar resultados sólidos en condiciones variables o desafiantes, como almacenamiento a largo plazo, capacitación limitada del usuario y condiciones ambientales adversas. . Para lograr este objetivo, la integración de la preparación de muestras, la medición y el informe en unidades únicas y fáciles de operar se están volviendo factibles utilizando técnicas de microfluidos [66]. Los estudios futuros deben centrarse en desarrollar un enfoque de diagnóstico de un solo paso más fácil de usar que involucre la liberación de ácido nucleico viral, la preamplificación, la detección mediada por CRISPR-Cas y la lectura de señales.

Otra desventaja de los sistemas CRISPR-Cas, en particular Cas9, es el efecto "fuera del objetivo", en el que Cas9 se une a sitios genómicos no deseados para la escisión. Tal efecto fuera del objetivo puede conducir potencialmente a resultados falsos negativos o positivos. Este problema se puede superar con el uso de software bioinformático para diseñar un sgRNA apropiado [101].

La automatización y la inteligencia artificial pueden fortalecer en gran medida la aplicación de los sistemas CRISPR-Cas en el diagnóstico viral. Los sistemas de diagnóstico basados ​​en CRISPR-Cas se pueden combinar con inteligencia artificial (IA) para proporcionar un sistema de alerta temprana para la detección rápida, asequible, precisa e inteligente de un agente infeccioso. En particular, se proporcionan kits de diagnóstico basados ​​en CRISPR-Cas fáciles de usar y portátiles a hospitales, centros de salud, comunidades o incluso individuos para la detección rápida y precisa de patógenos específicos. La recuperación del resultado de la prueba en el teléfono inteligente se logra a través de una aplicación. Los datos de varias ubicaciones se pueden almacenar y procesar en un sistema de computación en la nube a través del servicio 5G, al que puede acceder personal restringido para decisiones de apoyo o públicamente con fines de investigación. El sistema de computación en la nube calcula el riesgo de infección para generar un modelo equipado con IA actualizando los elementos de diagnóstico y luego advierte a los legisladores y a las personas [102,103,104]. Dicho sistema de alarma alimentado por IA de diagnóstico CRISPR-Cas proporciona una alerta temprana sobre el riesgo de virus infecciosos cercanos y sería muy útil para una respuesta oportuna y medidas apropiadas para prevenir la propagación de infecciones virales.

Las limitaciones y los inconvenientes de las técnicas de diagnóstico tradicionales abren nuevas vías para utilizar métodos de diagnóstico molecular sensibles y eficientes para el diagnóstico rápido de infecciones virales. Los sistemas basados ​​en CRISPR tipo II (Cas9), V (Cas12) y VI (Cas13) proporcionan herramientas de diagnóstico avanzadas para la detección y el control rápidos de virus de ADN y ARN. El desarrollo de nuevas plataformas basadas en CRISPR para el diagnóstico molecular de las hepatitis virales promete cambiar la atención médica y mejorar el manejo epidemiológico de esta enfermedad infecciosa a nivel mundial. Actualmente, los ensayos basados ​​en CRISPR desarrollados deben validarse mediante ensayos clínicos y la validación del ensayo debe monitorearse y mantenerse después de la implementación clínica para garantizar su rendimiento. A pesar de muchos desarrollos exitosos en la plataforma de diagnóstico basada en CRISPR-Cas, todavía queda un largo camino por recorrer desde el laboratorio hasta el uso práctico o clínico.

No aplica.

Virus del herpes simple

Citomegalovirus

Virus de Epstein Barr

virus de la varicela zoster

virus de la hepatitis A

virus de la hepatitis B

virus de la hepatitis C

virus de la hepatitis delta

virus de la hepatitis e

Carcinoma hepatocelular

Secuencias asociadas a CRISPR repetidas palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas

punto de atención

Reacción en cadena de la polimerasa

Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos

ADN de doble cadena

ADN circular covalentemente cerrado

Scavenger receptor clase B tipo I

ocluyendo

claudin-yo

Grupo de diferenciación 81

Inmunoensayos enzimáticos

Hepatitis B crónica

Insuficiencia hepática fulminante

Microscopio de electrones

PCR cuantitativa, NASBA: amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos

Amplificación isotérmica mediada por bucle

reacción en cadena de la ligasa

PCR con transcriptasa inversa

RCP digitales

Secuenciación de última generación

Amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos: escisión CRISPR

Reportero trans CRISPR dirigido a endonucleasas de ADN

DesBLOQUEO del reportero enzimático específico de alta sensibilidad

Motivo adyacente al protoespaciador

Sistema altamente eficiente multipropósito de bajo costo de una hora

Encontrar secuencias de baja abundancia por hibridación

Virus del Nilo Occidental

virus de la fiebre amarilla

síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2

Virus del papiloma humano

interferón-a

Análogos de nucleósidos

Similar a polipéptido catalítico 3 que edita ARNm de apolipoproteína B

ADN circular relajado

ARN pregenómico

Amplificación de desplazamiento cruzado múltiple

ADNasa dependiente de ATP segura para plásmidos

Amplificación de círculo rodante

Células mononucleares de sangre periférica

Amplificación isotérmica de bucle

Antivirales de acción directa

Sitio de entrada ribosómico interno.

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Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología, Teherán, Irán.

Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.

Departamento de Biotecnología Industrial y Ambiental, Instituto Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (NIGEB), Teherán, 1497716316, Irán

Howra Bahrulolum, Fatemeh Nouri Rouzbahani, Saghi Nooraei, Mehdi Mousavi Sameh y Gholamreza Ahmadian

Departamento de Biotecnología Animal, Instituto Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (NIGEB), Teherán, 1497716316, Irán

Hossein Tarrahimfrad

Centro de Investigación de Microbiología Aplicada, Instituto de Biología de Sistemas y Envenenamientos, Universidad de Ciencias Médicas de Baqiyatallah, Teherán, 1435916471, Irán

Abbas Hajizad

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GA diseñó el estudio. HB, HT, FNR, SN y MM redactan el borrador original. HB escribió la versión final del manuscrito. HB preparó figuras y tablas. GA y AH fueron responsables de la revisión y edición del borrador final. GA y AH contribuyeron a la administración y supervisión del proyecto. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Gholamreza Ahmadian.

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

No aplica.

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Reimpresiones y permisos

Bahrulolum, H., Tarrahimofrad, H., Rouzbahani, FN et al. Potencial del sistema CRISPR/Cas como herramientas emergentes en la detección de infección por hepatitis viral. Virol J 20, 91 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02048-5

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Recibido: 04 febrero 2023

Aceptado: 23 de abril de 2023

Publicado: 08 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02048-5

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