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Oct 25, 2023

Mapeo de oligonucleótidos a través de espectrometría de masas para permitir la caracterización integral de la estructura primaria de una vacuna de ARNm contra el SARS

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9038 (2023) Citar este artículo

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El mapeo de oligonucleótidos mediante cromatografía líquida con detección UV acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-UV-MS/MS) se desarrolló recientemente para respaldar el desarrollo de Comirnaty, la primera vacuna comercial de ARNm del mundo que inmuniza contra el virus SARS-CoV-2. De manera análoga al mapeo de péptidos de las modalidades de proteínas terapéuticas, el mapeo de oligonucleótidos descrito aquí proporciona una caracterización directa de la estructura primaria del ARNm, a través de la digestión enzimática, determinaciones de masa precisas y fragmentación inducida por colisión optimizada. La preparación de muestras para el mapeo de oligonucleótidos es una digestión rápida, en un solo recipiente y con una enzima. El resumen se analiza a través de LC-MS/MS con un gradiente extendido y el análisis de datos resultante emplea un software semiautomático. En un solo método, las lecturas de mapeo de oligonucleótidos incluyen un cromatograma UV altamente reproducible y completamente anotado con una cobertura de secuencia máxima del 100 %, y una evaluación de microheterogeneidad de la terminación del extremo 5′ y la longitud de la cola poli(A) del extremo 3′. El mapeo de oligonucleótidos fue fundamental para garantizar la calidad, la seguridad y la eficacia de las vacunas de ARNm al proporcionar: la confirmación de la identidad del constructo y la estructura primaria y la evaluación de la comparabilidad del producto después de los cambios en el proceso de fabricación. En términos más generales, esta técnica se puede utilizar para interrogar directamente la estructura primaria de las moléculas de ARN en general.

Dos vacunas de ARN mensajero (ARNm), Comirnaty de Pfizer-BioNTech y Spikevax de Moderna, han sido aprobadas por la FDA, EMA y otras agencias reguladoras de todo el mundo para combatir la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)1,2. El COVID-19 es causado por la infección por coronavirus-2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo3. Las vacunas de ARNm se pueden utilizar para la inmunización, ya que contienen las instrucciones genéticas para la autotraducción de la proteína inmunogénica diana4. El ARNm en las vacunas COVID-19 aprobadas codifica la proteína S-2P5, que se diferencia de la proteína del pico del SARS-CoV-2 por dos mutaciones estabilizadoras de prolina que generan una conformación de prefusión6. El principio activo (DS) del ARNm se fabrica mediante transcripción in vitro ( IVT) utilizando la polimerasa del bacteriófago T7 con N1-metil pseudouridina formando un ARN mensajero modificado con nucleósidos (modRNA). ModRNA DS se encapsula posteriormente con nanopartículas de lípidos (LNP) para el suministro celular y la protección contra las fuerzas de degradación. Los modRNA-LNP formulados comprenden el producto farmacéutico (DP) que se administra para la vacunación.

Los fabricantes de medicamentos tienen la responsabilidad absoluta de caracterizar y comprender la estructura molecular, la secuencia, la heterogeneidad y las impurezas de los medicamentos y vacunas finales que comercializan. La estructura primaria general del mRNA DS, desde el extremo 5′ hasta el 3′, es: 5′ Cap, 5′ región no traducida (UTR), región codificante de antígeno, 3′ UTR y 3′ cola de poliadenosina (poli(A) -tail)7 en un formato monocatenario. Para ser competente en la traducción, el ARNm debe tener un tope en su extremo 5'8 y tener una cola poli(A) con un número suficiente de nucleótidos de adenosina consecutivos9. El casquete 5′ suele ser un trifosfato de guanosina metilado en N7 terminal 5′ conectado al carbono 5′ de la ribosa del siguiente nucleótido de adenosina o guanosina, que también puede estar metoxilado en su carbono 2′10. Estos atributos de capuchón 5' y cola poli(A) también confieren estabilidad al proteger el ARNm de los procesos de degradación celular11,12. La integridad de la estructura primaria del ARNm de longitud completa, incluida la terminación de la cola de poli (A) y la tapa 5 ', representan atributos de calidad críticos para la vacuna DS que se controlan de cerca para garantizar la calidad deseada del producto.

En las últimas décadas se han desarrollado múltiples técnicas cromatográficas y electroforéticas de "mapeo de oligonucleótidos"13,14,15. Más recientemente, se han desarrollado métodos de caracterización de ARNm basados ​​en espectrometría de masas (MS) que utilizan cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa de pares iónicos acoplada a espectrometría de masas (IP RP-HPLC-MS) para la caracterización en profundidad de las vacunas de ARNm 5 'Cap16 y 3′-Poly(A)-tail17. Sin embargo, estos requieren purificación y métodos analíticos dedicados para la caracterización de cada terminal. Recientemente se han desarrollado métodos analíticos adicionales que utilizan digestiones enzimáticas e IP RP-HPLC con y sin MS en tándem (MS/MS) para la secuenciación de oligonucleótidos de ARN grande18,19,20,21,22. Se han evaluado varias enzimas22 en solución o RNasa T1 inmovilizada en partículas magnéticas para mejorar la cobertura de la secuencia. Nakayama et al. desarrolló un método de perfilado de ARNm basado en LC-MS utilizando estándares marcados con isótopos estables. A pesar del trabajo pionero sobre la caracterización de la estructura primaria del ARN discutido anteriormente18,19,20,21,22, es beneficioso para el campo tener un método analítico que sea completo y simple de emplear. Un mapa de oligonucleótidos ideal para una implementación sencilla es uno capaz de caracterizar directa y eficientemente la longitud completa del ARN, incluida la heterogeneidad del extremo 5 'Cap y 3' terminal, en una digestión de una enzima y un solo recipiente, que no requiere marcado con isótopo estable. control S. Resuelve los isómeros de secuencia y produce un cromatograma UV completamente anotado con un mapa de cobertura de secuencia máxima.

En este documento, describimos un método de mapeo de oligonucleótidos para la caracterización directa y completa de la estructura primaria de ARNm de longitud completa, utilizando Comirnaty como estudio de caso. Nuestro método de mapeo de oligonucleótidos emplea cromatografía líquida de ultra alto rendimiento de fase reversa de par de iones de última generación con detección UV (IP-RP-UHPLC-UV) acoplada a espectrometría de masas en tándem de ionización por electrospray de ultra alta resolución (ESI MS/MS) para separar e identificar los fragmentos de oligonucleótidos generados a partir de la digestión con ribonucleasa T1 (RNasa T1). Las herramientas de análisis de datos personalizadas permiten lecturas integrales semiautomáticas de la estructura primaria: (1) cromatograma UV completamente anotado con cientos de productos de digestión que representan la huella digital específica de la estructura primaria del ARNm, (2) mapa de cobertura que muestra una cobertura de secuencia única y máxima, ( 3) Evaluación de la microheterogeneidad del casquete 5′ y del terminal 3′.

La vacuna Pfizer-BioNTech COVID-19 se lanzó en 186 mercados a nivel mundial a partir de julio de 202223. Para facilitar este lanzamiento, se completaron y presentaron ante las autoridades sanitarias de todo el mundo una serie de estudios de elucidación estructural y comparabilidad utilizando el mapeo de oligonucleótidos. Esto demostró que los nuevos sitios de fabricación de DS y el aumento de las escalas de producción, introducidos para expandir la capacidad y el suministro global de la vacuna, produjeron ARNm con una calidad de producto comparable a los lotes contemporáneos. Aquí, nuestro método de mapeo de oligonucleótidos facilitó la evaluación completa de la estructura primaria de Comirnaty DS en un solo método con una cobertura de secuencia máxima del 100 %. Los parámetros de fragmentación MS/MS optimizados y el software especializado junto con el software comercial fueron esenciales para distinguir los isómeros de secuencias de oligonucleótidos para una cobertura de secuencia máxima alta. Nuestro método completo y semiautomático de mapeo de oligonucleótidos se desarrolló para proporcionar una caracterización mejorada de ARNm de longitud completa de secuencias, formas terminales y posibles modificaciones. Es un componente crítico de la comprensión de la estructura primaria del ARNm, la evaluación de la comparabilidad y puede usarse como un ensayo de identidad DS ortogonal para diferenciar secuencias de ARNm muy similares derivadas de variantes del SARS-CoV-2.

El mapeo de oligonucleótidos se desarrolló con un lote representativo de Comirnaty BNT162b2 Original DS (es decir, la vacuna original Pfizer-BioNTech COVID-19 que codifica la glicoproteína de pico (S) del virus SARS-CoV-2, el aislado Wuhan-Hu-1 : GenBank: QHD43416.1) y se ha aplicado a construcciones Comirnaty BNT162b2 posteriores (BNT162b2s04 [Delta] y BNT162b2s05 [Omicron]) y otras moléculas de ARNm de cartera. Cincuenta microgramos de mRNA DS se digirieron con 2500 U de RNasa T1 en un tampón Tris (hidroximetil) aminometano (Tris) 50 mM pH 7,5 con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 20 mM durante 90 min a 37 °C. La solución de fragmentos enzimáticos resultante se enriqueció con 10x trietilamina (TEA) y emulsión de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para dar una concentración v/v final de TEA al 0,1 %, TEA al 1 %. HFIP. Se inyectó una carga de 4 µg y los fragmentos se separaron mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución de fase reversa de par iónico (IP RP-UHPLC) con detección UV a 260 nm utilizando un sistema 1290 Infinity II Bio LC (Agilent) combinado con un oligonucleótido ACQUITY Premier Columna C18: 130 Å, 1,7 µm, 2,1 × 150 mm (Waters). Cada fase móvil contenía 0,1 % de TEA y 1 % de HFIP. El TEA funciona como agente de emparejamiento de iones y el HFIP proporciona un tampón compatible con MS como un ácido débil volátil. El gradiente avanzó de 1 a 17 % de fase móvil B (50 % de metanol) en 195 min, luego de 17 a 35 % de B en 60 min, seguido de segmentos de lavado y equilibrio. El caudal fue de 0,2 ml/min con una división posterior a la columna: 50 µl/min al detector de matriz de diodos UV y 150 µl/min a un espectrómetro de masas Orbitrap Eclipse Tribrid (Thermo Fisher Scientific). La adquisición de MS de ionización por electrospray (ESI) en línea se realizó en modo de iones negativos con un voltaje de spray de 2700 V. Los escaneos de MS fueron de 400 a 2000 m/z a 120 000 de poder de resolución (RP) a 400 m/z. La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) se logró a 30 000 RP mediante una disociación de colisión de alta energía (HCD) de 17, 21 y 25 pasos de candidatos precursores de carga múltiple seleccionados por el algoritmo de adquisición dependiente de datos (DDA).

Se usó el software BioPharma Finder versión 5.0 (Thermo Fisher Scientific) para identificar oligonucleótidos basados ​​en coincidencias tanto de MS como de MS/MS con productos de digestión de RNase T1 teóricos. Una coincidencia de MS requería que la masa neutra del oligonucleótido observado estuviera dentro de 5 ppm de la masa teórica. Una coincidencia MS/MS requería que se identificaran todos los fragmentos principales y que la secuencia completa pudiera deducirse de los iones de fragmento que contenían los extremos 5' o 3' (no fragmentos internos). Para asegurarse de que el software automatizado empleara una coincidencia estricta de MS/MS, el software también buscó en todo el conjunto de datos de LC-MS/MS frente a resúmenes teóricos de RNase T1 de construcciones señuelo que tenían arreglos aleatorios de la misma composición de nucleótidos que la molécula de ARNm. Para aumentar la lista de identificaciones de software automatizadas, se emplearon secuencias de comandos Excel Visual Basic for Applications (VBA) para examinar las características LC-UV no identificadas y los espectros de masas subyacentes uno por uno. Se empleó el software Protein Metrics Byos para caracterizar los extremos 5' o 3', incluido el R1062 de 73 unidades y su especie de cola poli(A) relacionada. Las identificaciones de 5 'o 3' se realizaron utilizando espectros de masas de carga cero desconvolucionados, sin MS / MS.

El método paso a paso detallado se proporciona como un documento de datos complementarios que describe el tratamiento enzimático de la muestra, la separación y detección de oligonucleótidos por UHPLC-UV, y la identificación de oligonucleótidos por espectrometría de masas de alta resolución. También describe cómo usar varias herramientas Excel VBA, el software BioPharma Finder y Protein Metrics Byos para lograr una caracterización mejorada del resumen de ARNm.

Las agencias reguladoras consideran que la estructura primaria del ARNm destinado a una vacuna o fármaco terapéutico es un atributo de calidad crítico y su integridad debe confirmarse empíricamente para garantizar la calidad, la seguridad y la eficacia. La técnica ideal de caracterización de la estructura primaria proporciona una aclaración inequívoca de la secuencia de ARNm de longitud completa, los extremos 5' y 3' y cualquier modificación específica del sitio mediante la medición directa de la molécula de ARNm.

Se desarrolló un método de mapeo de oligonucleótidos de una sola enzima para caracterizar directamente la estructura primaria del ARNm original de Comirnaty BNT162b2 mediante la combinación de IP RP-HPLC-UV-MS y MS/MS para separar e identificar todos los oligonucleótidos producidos a través de la digestión con RNasa T1. Permitió la detección de 388 oligonucleótidos. Setenta y cuatro de estos oligonucleótidos aparecen más de una vez en la construcción: son repeticiones de motivo de secuencia con diferentes posiciones iniciales (loci). Si tales oligonucleótidos observados se originan en cada locus en la construcción tras la digestión con RNase T1, entonces los 4283 nucleótidos teóricos en BNT162b2 han sido muestreados por el método. Por lo tanto, la cobertura de secuencia máxima posible lograda por este método fue del 100%. Los otros 314 oligonucleótidos se originan cada uno de un solo locus en la construcción. No hay ambigüedad en su origen: representan 2380 nucleótidos, dando una cobertura de secuencia única del 55,6%. Con la excepción de los oligonucleótidos de cola poli(A) larga, todos los oligonucleótidos se identificaron mediante coincidencia de espectro de fragmentación MS/MS.

La digestión del ARN con RNasa T1 escinde el esqueleto de fosfodiéster en el lado 3′ de cada nucleótido de guanosina y deja un fosfato en el carbono 3′ de la ribosa de guanosina del extremo 3′. Por lo tanto, no hay fosfato en el carbono 5' del nucleótido ribosa del extremo 5' de un producto de digestión con RNasa T1. Un producto de digestión de escisión perdida es un oligonucleótido con uno o más nucleótidos de guanosina internos (no terminales 3'). Una digestión teórica con RNasa T1 de BNT162b2 crea 1062 oligonucleótidos que se agrupan en 302 oligonucleótidos únicos debido a las repeticiones del motivo de secuencia en la construcción. De los 388 oligonucleótidos identificados en el estudio, 302 son productos de digestión teóricos de RNase T1. Los otros 86 oligonucleótidos incluyen 23 poli(A)-cola adicionales, 49 escisión perdida y 14 oligonucleótidos de escisión no específica (Tabla 1 de datos complementarios).

La primera lectura del mapeo de oligonucleótidos es un cromatograma UV completamente anotado de los productos de digestión de RNase T1 (Fig. 1A), que se genera al hacer coincidir los tiempos de retención de cada oligonucleótido identificado por MS con su pico UV correspondiente. En general, el método separa las especies por el número de residuos de nucleótidos, eluyendo los oligonucleótidos más cortos antes que los oligonucleótidos más largos. Las interacciones dominantes estacionarias de fase inversa-analito son con pares de iones de la columna vertebral trietilamonio-fosfodiéster. Para cada subconjunto de longitudes de oligonucleótidos, el orden de elución está influenciado por la composición de las nucleobases y la secuencia. En particular, el nucleótido del extremo 5' influye en este orden. Para oligonucleótidos de la misma longitud, el orden de elución tiende a ser primero C, luego V, luego A (V representa N1-metil pseudouridina; Datos complementarios Fig. 1).

Mapa de oligonucleótidos de RNasa T1 de BNT162b2 DS original. (A) Mapa de oligonucleótidos IP RP-UHPLC-UV-MS/MS RNase T1 de BNT162b2 Original DS, 14–254 min. "R" representa productos de digestión de oligonucleótidos con RNasa T1 indexados desde el extremo 5' al 3'. "*" denota un oligonucleótido de repetición de secuencia, donde la asignación de pico único representa todos los oligonucleótidos idénticos en la secuencia. Cada color distingue el número de nucleótidos por producto de digestión: azul: 4, 10 y 16; verde: 5 y 11; oro: 6 y 12; rojo: 7 y 13, morado: 8 y 14, negro: 9 y 15, magenta: > 16. Para mayor claridad gráfica, no todos los oligonucleótidos observados se anotan en el cromatograma; una lista completa se encuentra en la Tabla de datos complementarios 1. (B) Mapa de oligonucleótidos IP RP-UHPLC/UV/MS/MS RNase T1 de BNT162b2 Original DS, 0–20 min. "R" representa productos de digestión de oligonucleótidos con RNasa T1 indexados desde el extremo 5' al 3'. "*" denota un oligonucleótido de repetición de secuencia, donde la asignación de pico único representa todos los oligonucleótidos idénticos en la secuencia. Cada color distingue el número de nucleótidos por producto de digestión: rojo: 1; púrpura: 2; negro: 3; azul: 4; verde: 5. Para mayor claridad gráfica, no todos los oligonucleótidos observados están anotados en el cromatograma; una lista completa se encuentra en la Tabla de datos complementarios 1. (C) La cobertura de secuencia única del 55,6 % se ilustra sombreada en azul y verde, según 314 oligonucleótidos de secuencia única observados. Los nucleótidos azules comprenden oligonucleótidos de RNasa T1 de secuencia única; los nucleótidos verdes comprenden oligonucleótidos fragmentados y de escisión perdida de secuencia única. Los nucleótidos verde y blanco también comprenden oligonucleótidos de RNasa T1 de secuencia repetida, basados ​​en 74 oligonucleótidos de secuencia repetida observados. "V" es N1-metil pseudouridina.

Debido a las repeticiones de motivo de secuencia, algunas características en el mapa de oligo se originan en más de un locus de digestión. Por ejemplo, el producto de digestión "AAAG" que eluye a los 15,8 min es un oligonucleótido de repetición de secuencia que puede originarse a partir de uno o hasta los 4 de sus loci en la secuencia. El primer locus AAAG en la construcción BNT162b2 está en los residuos de nucleótidos 514-517; sigue al G 118 contando desde el extremo 5' y por lo tanto se designa como el oligonucleótido "R119". Este oligonucleótido 4-mer tiene cuatro cromóforos UV de 260 nm y su área máxima de LC/UV es de 2,88 × 105 (Tabla 1 de datos complementarios). Ningún otro oligonucleótido coeluye con esta especie. El R606 de 15 mer con la secuencia ACCCCVCCVAVCAAG eluye a los 205 min sin especies coeluyentes y con un área de pico de 2,55 × 105. Por similitud en las áreas de pico y en la estequiometría de los cromóforos, es razonable concluir que la característica AAAG de 16 min es compuesto por los cuatro productos de digestión de oligonucleótidos RNasa T1 AAAG (R119, R731, R914 y R1046). Las áreas de los picos de LC/UV observadas de todos los picos se compararon con sus áreas de pico predichas (teóricas) dada su asignación de oligonucleótidos, lo que muestra que los picos de LC-UV compuestos por oligonucleótidos de repetición de secuencia tienen contribuciones de todos sus loci (Datos complementarios Fig. 2) . Por lo tanto, el mapeo de oligonucleótidos de BNT162b2 logró una cobertura de secuencia máxima posible del 100%.

Para simplificar el cromatograma del mapa de oligonucleótidos en la Fig. 1, las secuencias repetidas se anotaron con la primera instancia de locus con un sufijo de asterisco; por lo tanto, la característica de 16 min es "R119*". La mayoría de los picos "*" son oligonucleótidos pequeños: 1-meros (G), 2-meros (AG, CG, VG), 3-meros (AAG, etc.); el más grande es un VACAVCVG de 8 unidades, que se encuentra en dos sitios (R566 y R947). Estas secuencias repetidas constituyen una parte significativa de la construcción BNT162b2. El cromatograma UV temprano (Fig. 1A y B) muestra picos que representan secuencias repetidas que tienen áreas de pico significativas, acordes con el número de loci para cada especie (Tabla 1 de datos complementarios).

Si bien las especies de escisión perdida se detectan a niveles bajos, estas abundantes secuencias repetidas indican que la digestión de RNase T1 se completa en gran medida a los 90 min. De manera similar al tratamiento convencional de péptidos no únicos cuando se realiza el mapeo de péptidos por LC-MS/MS24, cada locus de un oligonucleótido no único se considera en la determinación de la cobertura de secuencia máxima. Esto también está justificado dada la correlación entre las áreas máximas de UV observadas y predichas (Datos complementarios Fig. 2).

La segunda lectura del mapeo de oligonucleótidos es el mapa de cobertura de secuencia único de cada nucleótido detectado (Fig. 1C). Al considerar el subconjunto de oligonucleótidos que tienen solo 1 locus, la cobertura de secuencia única fue del 55,5 %. Se observaron todos los oligonucleótidos de secuencia única de digestión con RNasa T1 teóricos.

Los cambios en los procesos de fabricación clínicos y comerciales (p. ej., sitio, escala) son comunes durante la producción de vacunas de ARNm, y las técnicas analíticas deben demostrar la comparabilidad del producto para los lotes previos y posteriores al cambio25. El mapeo de oligonucleótidos proporciona una evaluación directa y detallada de la comparabilidad de la estructura primaria del ARNm en múltiples lotes de DS de ARNm. Esto es análogo a la aplicación del mapeo de péptidos por LC-UV-MS/MS para la evaluación de comparabilidad de lotes de proteínas terapéuticas26. La estructura primaria del ARNm de tres lotes comerciales de BNT162b2 se consideró comparable (Fig. 2A), como lo demuestra la superposición de los cromatogramas completos y la superposición de segmentos ampliados de los cromatogramas (Datos complementarios Fig. 3).

Comparabilidad de lotes e identidad de construcción ensayada mediante mapeo de oligonucleótidos. (A) Se evaluaron tres lotes de BNT162b2 Original DS fabricados con GMP mediante mapeo de oligonucleótidos. Los cromatogramas UV resultantes son visualmente comparables, lo que demuestra la consistencia del proceso. Datos complementarios La Fig. 3 proporciona una ampliación de seis segmentos de estos datos. El lote 3 se hizo a pequeña escala; Los lotes 1 y 2 se realizaron mediante el mismo proceso GMP. (B) Mapas de oligonucleótidos parciales de BNT162b2 Original, BNT162b2 Delta y BNT162b2 Omicron mRNA DS. Las secuencias de oligonucleótidos digeridas por ARNasa T1 que se muestran en negro son compartidas por las 3 construcciones variantes; las secuencias azules son compartidas por las construcciones BNT162b2 Original y BNT162b2 Delta; el verde es compartido por las construcciones BNT162b2 Original y BNT162b2 Omicron; y los oligonucleótidos naranja y rojo son exclusivos de las construcciones BNT162b2 Delta y BNT162b2 Omicron, respectivamente. (C) Mapas de oligonucleótidos parciales de dos lotes de BNT162b2 Original superpuesto (panel superior) y un lote de BNT162b2 Original superpuesto con BNT162b2 Delta (panel inferior). Las diferencias entre los cromatogramas de construcción BNT162b2 Original y BNT162b2 Delta se anotan con los oligonucleótidos que representan la diferencia. Los oligonucleótidos azules son compartidos por las construcciones BNT162b2 Original y BNT162b2 Delta; el oligonucleótido naranja es exclusivo de la construcción BNT162b2 Delta. Los números entre paréntesis cuentan el número de repeticiones de secuencia en cada secuencia de construcción: el rojo representa la cantidad de ocurrencias en la construcción BNT162b2 Delta y el negro significa la cantidad de ocurrencias en la construcción BNT162b2 Original.

En un análisis comparativo similar, el mapeo de oligonucleótidos puede identificar variaciones únicas y sutiles en la estructura primaria del ARNm. Las secuencias de construcciones de vacunas variantes SARS-CoV-2 Delta y Omicron, BNT162b2 Delta y BNT162b2 Omicron, son 99,6 % y 98,6 % similares a BNT162b2 Original, como se muestra en Datos complementarios Fig. 4. Las estructuras primarias de ARNm de las tres construcciones exhibieron un pico distinto diferencias de perfil por mapeo de oligonucleótidos (Fig. 2B), debido a los oligonucleótidos que están presentes o están ausentes de al menos uno de los tres. De los dos oligonucleótidos originales, uno Delta y 15 Omicron que son exclusivos de su construcción, 16 se diferenciaron claramente por UV y por análisis de cromatograma de iones extraídos de la manera esperada (ausente en dos mapas de construcción, presente en uno; Datos complementarios Fig. 5). Diecisiete de los 18 tenían MS/MS definitiva. Solo el VCAG de 4 unidades exclusivo de Omicron coeluyó con isómeros de secuencia que impidieron una identificación MS/MS segura.

El mapeo de oligonucleótidos también revela diferencias sutiles en la estructura primaria entre estas construcciones variantes. Se observan tres diferencias notables entre los oligonucleótidos BNT162b2 Original BNT162b2 Delta en la ventana cromatográfica de 16 a 30 minutos (Fig. 2C). La primera diferencia es un hombro frontal elevado del pico Delta UV de 19 min. Esto se explica por el oligonucleótido CCVVG, identificado en el mapa BNT162b2 Delta pero no en el mapa BNT162b2 Original. Es un producto de digestión de RNase T1 esperado solo de la secuencia BNT162b2 Delta, y representa un punto de diferencia entre las secuencias BNT162b2 Original y BNT162b2 Delta. El pico UV a los 21,8 min, identificado como VVCCG, es menos abundante en el cromatograma BNT162b2 Delta que en el cromatograma BNT162b2 Original. Esto ocurre porque es un oligonucleótido de secuencia repetida con dos loci en la secuencia BNT162b2 Original y un locus en la secuencia BNT162b2 Delta. Por el contrario, el pico UV a los 27,0 min, identificado como ACCAG, es más abundante en Delta en relación con BNT162b2 Original porque este oligonucleótido se origina a partir de cinco loci en la primera secuencia y cuatro loci en la última.

Es importante destacar que no se observan otras diferencias en esta ventana cromatográfica de 16 a 30 minutos (Fig. 2C), de acuerdo con la tabulación teórica de los oligonucleótidos digeridos con RNasa T1 esperados. La superposición exacta entre los cromatogramas de estas variantes muestra que tienen el mismo número estequiométrico de un solo oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos. Además, el análisis comparativo de BNT162b2 Original frente a Delta mediante el mapeo de oligonucleótidos proporciona un contrapunto visual importante de la comparación de lote a lote, en el que la afirmación de comparabilidad visual por superposición es apropiada.

La protección adecuada del extremo 5' y la longitud adecuada del extremo poli(A) 3' son atributos de calidad críticos para una vacuna o tratamiento de ARNm. El mapa de oligonucleótidos desarrollado aquí permite la caracterización directa de la tapa 5 'y la cola poli (A) 3' en una sola técnica, sin necesidad de aislamiento y purificación de ninguno de los extremos (Fig. 3). Los cromatogramas iónicos extraídos del extremo 5′ (Fig. 3A) y los espectros de masas desconvolucionados que lo acompañan demuestran una detección inequívoca de especies sin tapar a nivel de trazas (5′ppp-AG como se indica en las Fig. 3A y B) en relación con la forma tapada correctamente ( 5 'cap-AG como se indica en la Fig. 3A y C) en BNT162b2 Original, Delta y Omicron, usando masa precisa de alta resolución. La mayor parte del extremo 5 'está correctamente tapado en cada construcción (esto se confirmó mediante un análisis ortogonal basado en LC-UV; no se muestran los datos).

El mapeo de oligonucleótidos del ARNm permite la caracterización simultánea de los extremos 5′ y 3′ sin purificación por afinidad. (A) Cromatogramas de iones extraídos ([M-1H]1–, [M-2H]2–) de versiones sin tapar (5′ppp-AG) y tapadas (5′cap-AG) del oligonucleótido terminal 5′ para BNT162b2 construcciones variantes Original, Delta y Omicron. (B, C) Espectros de masas desconvolucionados de carga cero de las versiones sin tapar (5′ppp-AG) y tapada (5′cap-AG), respectivamente, del oligonucleótido terminal 5′ para construcciones variantes BNT162b2 Original, Delta y Omicron . Los espectros se desconvolucionan a partir de la suma de escaneos dentro de las regiones resaltadas en el panel A, utilizando Byos v4.4 (Protein Metrics). Las masas observadas (monoisotópicas) concuerdan con las masas teóricas dentro de 3 ppm, lo cual es consistente con la exactitud y precisión de los espectrómetros de masas Orbitrap. (D) Cromatogramas UV (260 nm) de la región de la cola de poli(A) para construcciones variantes de BNT162b2 Original, Delta y Omicron: las regiones de oligonucleótidos de poli(A) A30 y L70 que consisten en las fórmulas genéricas C[A]nG, y ACV[A]n, se etiquetan en consecuencia. Los picos de poli(A) A30 separados cromatográficamente se marcan según el número de adenosinas detectadas en cada oligonucleótido. El asterisco (*) indica una distribución de oligonucleótido poli(A) A30 separada que resulta de la escisión perdida del oligonucleótido poli(A) A30, que consta de la fórmula genérica CCACACCCVGGAGCVAGC[A]nG. El recuadro azul resalta la distribución cromatográfica de los oligonucleótidos poli(A) L70 (sin separar) que se describen con más detalle en los paneles (E y F). (E) Espectros de masas desconvolucionados de carga cero de la distribución de oligonucleótidos poli(A) L70 a partir de la suma de escaneos dentro de la región encuadrada en azul resaltada en el panel (D). Los picos del espectro de masas se etiquetan según el número de adenosinas detectadas en cada oligonucleótido L70 poli(A). El asterisco doble (**) indica distribuciones de oligonucleótidos poli(A) L70 separadas que resultan de la degradación artificial de los oligonucleótidos poli(A) L70 durante la preparación de la muestra. Las masas observadas (monoisotópicas) concuerdan con las masas teóricas dentro de 5 ppm, lo cual es consistente con la exactitud y precisión de los espectrómetros de masas Orbitrap. Se produjeron errores de masa de ~ 1 y 2 Da debido a la eliminación de isótopos en ciertas especies en las distribuciones L70 poli(A) debido a la abundancia relativa a nivel de trazas de estas especies o la interferencia de señales de otras especies; más específicamente, la señal/ruido insuficiente o la interferencia dan como resultado distribuciones de isótopos no estadísticas que conducen a errores en la determinación de la masa monoisotópica. (F) Cromatogramas desconvolucionados extraídos (XDC) de la distribución de oligonucleótidos poli(A) L70 original BNT162b2 resaltada en el panel (E). El sombreado coloreado de cada oligonucleótido en el panel (E) corresponde a su XDC.

La cola poli(A) codificada por la plantilla del plásmido de ADN de BNT162b2 Original, A30L70, consta de un tramo de 30 residuos de adenosina (segmento A30), seguido de una secuencia enlazadora de 10 nucleótidos y 70 residuos de adenosina contiguos adicionales (segmento L70). Debido al deslizamiento transcripcional de la polimerasa IVT T727, se observa más de una especie de cola poli(A). La distribución de A30 poli(A) se resuelve cromatográficamente con una resolución de un solo nucleótido mediante el mapa de oligonucleótidos (Fig. 3D) y se confirma mediante un perfil espectrométrico de masas (datos no mostrados). Esto confirma que la mayoría de las longitudes del segmento A30 poli(A) en BNT162b2 Original, Delta y Omicron se encuentran dentro de un rango de 29-33 residuos de adenosina.

La distribución del segmento L70 poli(A) eluye como un solo pico cromatográfico amplio. El mapa de oligonucleótidos se ajusta específicamente para la detección adecuada de MS de productos de digestión de RNasa T1 más grandes en este segmento del cromatograma para caracterizar la distribución de las especies L70 poli(A) (Fig. 3E). Las masas monoisotópicas observadas de las especies L70 poli(A) se asignaron en base a una concordancia precisa de masas con las masas teóricas esperadas. El mapeo de oligonucleótidos confirmó que la mayoría de las longitudes de los segmentos L70 poli(A) oscilaban entre 71 y 88 en BNT162b2 Original. Los cromatogramas de carga cero extraídos de la distribución BNT162b2 Original L70 poly(A) demuestran que el aumento del tiempo de elución se correlaciona con el aumento de la longitud del poli(A) (Fig. 3F). Por lo tanto, la longitud del poli(A) L70 es un fiel reflejo de la construcción del ARNm y no de la fragmentación artificial inducida por la ionización por electropulverización en el espectrómetro de masas. Además, el mapa de oligonucleótidos tiene la sensibilidad y especificidad para detectar cambios sutiles en la distribución de L70 poli(A) debido al deslizamiento transcripcional28: las distribuciones de L70 poli(A) de Delta y Omicron son ligeramente más cortas que BNT162b2 Original (Fig. 3E).

El mapeo de oligonucleótidos generalmente requiere escalas de iones de fragmentos de MS/MS completas para una identificación adecuada en una amplia gama de longitudes de secuencia (2 meros a > 20 meros). De las 302 secuencias de oligonucleótidos únicas generadas por una digestión in silico con ARNasa T1 de BNT162b2 Original, 220 son isómeros de secuencia. Éstos comparten la misma composición y, por lo tanto, la misma masa con al menos otro oligonucleótido, y muchos difieren solo en un único intercambio de nucleótidos entre dos posiciones. Los isómeros de secuencia requieren espectros MS/MS de alta calidad para su identificación.

Históricamente, la fragmentación MS/MS de oligorribonucleótidos se ha realizado mediante disociación inducida por colisión (CID)29,30. En este trabajo, utilizamos una versión actualizada de la técnica, disociación por colisión de mayor energía (HCD), para el mapeo de oligonucleótidos. Se realizaron estudios experimentales para examinar los efectos de la energía HCD, la longitud de los oligonucleótidos y el estado de carga en los tipos de iones de fragmentos de oligonucleótidos y el grado de fragmentación contigua a lo largo del esqueleto de ARN para una cobertura de secuencia óptima. En general, los patrones de fragmentación eran complejos, y a menudo incluían los cuatro tipos principales de iones de fragmentos terminales 5′ (a,b,c,d) y 3′ (w,x,y,z)31. Algunos espectros de HCD contenían fragmentos de iones a los que les faltaba una base de identificación única (-B) y fragmentos internos nacidos de más de una rotura de enlace fosfodiéster. Observamos que los fragmentos internos tienen un uso limitado para inferir la secuencia del supuesto oligonucleótido y disminuyen la calidad de los espectros al degradar fragmentos terminales informativos y agregar masas interferentes. Para evaluar el efecto de la energía de HCD en los espectros en la totalidad del mapa de oligonucleótidos, se controló la cobertura de la secuencia del constructo de ARNm. Las energías HCD fijas 17, 21 y 25 fueron óptimas (Fig. 4A) entre una serie de adquisiciones HCD MS/MS fijas de energía única. La mayor cobertura de secuencias de construcciones de ARNm se obtuvo al combinarlas en un método HCD 17, 21, 25 escalonado.

La energía HCD óptima y la densidad de carga impulsan la fragmentación adecuada. (A) Cobertura de secuencia máxima original BNT162b2 relativa determinada por mapeo de oligonucleótidos en función de la energía HCD. La cobertura de secuencia máxima resultante de cada condición se normaliza a la condición final recomendada (pasos HCD 17, 21, 25). La cobertura máxima de secuencias se restringió solo a los oligonucleótidos identificados por BioPharma Finder utilizando una restricción del parámetro de puntuación de confianza del 100 %. (B) Espectros MS/MS y cobertura de iones de fragmentos de 3 oligonucleótidos, presentados en función de la energía HCD y la longitud del oligonucleótido. Los espectros MS/MS se generan usando energías HCD: 13, 21, 33 y 45, aplicadas a oligonucleótidos 7mer, 14mer y 21mer. Los iones de fragmentos identificados como 5' (a,b,c,d), 3' (w,x,y,z) y los fragmentos internos se anotan mediante un código de colores como se define en la clave. La identificación y anotación de iones de fragmentos se realizó utilizando una herramienta Visual Basic Excel desarrollada internamente. (C) Espectros de MS/MS y cobertura de iones de fragmentos de 3 oligonucleótidos, presentados en función de la carga y la longitud del oligonucleótido. Los espectros de MS/MS se generan utilizando un método HCD de energía de un solo paso (17, 21, 25) en estados de carga baja, media y alta de los mismos oligonucleótidos de 7, 14 y 21 unidades presentados en el panel B. Iones de fragmento identificados como 5′ (a,b,c,d), 3′ (w,x,y,z) y los fragmentos internos se anotan mediante un código de colores como se define en la clave. La identificación y anotación de iones de fragmentos se realizó utilizando una herramienta Visual Basic Excel desarrollada internamente.

Estos resultados se entienden específicamente examinando la cobertura de iones de fragmentos producidos en espectros MS/MS en función de la energía HCD y la longitud del oligonucleótido (Fig. 4B). Las densidades de carga iónica del fragmento de oligonucleótido se mantuvieron constantes para todos los espectros en este ejemplo: 2,3 nucleótidos por carga. Los espectros de masas de oligonucleótidos más cortos contenían típicamente una gama completa de iones de fragmentos discernibles independientemente de la energía HCD. La energía HCD tuvo un mayor efecto sobre los oligonucleótidos más largos; las energías más bajas no produjeron niveles adecuados de iones de fragmentos productivos para la secuenciación. A medida que aumenta la energía de HCD, los iones de fragmentos terminales 5 '(a, b, c, d) y 3' (w, x, y, z) susceptibles de secuenciación aumentan en abundancia. La energía HCD se correlaciona positivamente con la abundancia de iones de fragmentos internos, por lo que no se recomienda una energía HCD superior a 25. El discernimiento de la secuencia se pierde desde la mitad de los oligonucleótidos cuando los fragmentos terminales más largos se fragmentan aún más en fragmentos internos. Esta tendencia continúa a medida que aumenta la energía de HCD y solo quedan los oligonucleótidos más cortos, algunos de los cuales son fragmentos terminales cortos. Una energía HCD de 21 produjo un equilibrio ideal de iones de fragmentos terminales relativamente abundantes para secuenciar y mitigar la fragmentación interna.

La cobertura de iones del fragmento MS/MS también se estudió en función del estado de carga y la longitud del oligonucleótido (Fig. 4C). La energía de HCD se mantiene constante en la condición recomendada de energías de colisión de HCD escalonadas: 17, 21, 25. Para todas las longitudes de oligonucleótidos, los estados de carga más bajos generalmente produjeron la cobertura de iones de fragmento más baja, y los estados de carga más altos generalmente produjeron el ion de fragmento más alto. cobertura. Los iones de fragmentos de un precursor de estado de carga más bajo pueden permitir una cobertura de secuencia adicional en una posición específica en algunos casos por dos razones principales: (1) el estado de carga más alto tiene una abundancia significativamente menor que un estado de carga más bajo y/o (2) los iones de fragmentos cargados se superponen con los iones de fragmentos de menor carga, confundiendo la identidad de ambos.

Observamos que el aumento de la densidad de carga de los oligonucleótidos tuvo un efecto positivo en la fragmentación que permite la secuenciación. Por ejemplo, el estado de carga [M-4H]-4 del 7-mero (1,75 nucleótidos/carga) produce abundantes iones de fragmentos y una cobertura total de iones de fragmentos (Fig. 4C). Sin embargo, el estado de carga [M-4H]-4 del 21-mero (5,25 nucleótidos/carga) produce iones de fragmentos relativamente débiles, lo que solo permite la secuenciación de los primeros nucleótidos en cada terminal. Este fenómeno es más pronunciado a medida que aumenta la longitud del oligonucleótido. La secuenciación MS/MS de oligonucleótidos con densidades de carga < ~ 2,5 combinada con HCD escalonado 17, 21, 25 proporcionó una fragmentación adecuada en el mapa de oligonucleótidos. Afortunadamente, las condiciones IP RP-UHPLC-ESI MS generan estados de carga progresivamente más altos con oligonucleótidos más grandes que eluyen más tarde; esto mantiene la densidad de carga ideal para la secuenciación MS/MS. Por lo general, MS/MS añadía poco valor al secuenciar dos estados de carga diferentes del mismo oligonucleótido.

La fragmentación óptima de HCD permitió la diferenciación exitosa de casi todos los isómeros de secuencia en el mapa de oligonucleótidos. La Figura 5 demuestra esto con un escenario desafiante pero común. Se representan tres isómeros de secuencia en un cromatograma de iones extraídos (Fig. 5A). El isómero "2" que eluye a los 75 min coeluye con otros oligonucleótidos de masa muy similar (Fig. 4C), lo que aumenta el riesgo de aislar dos oligonucleótidos no relacionados para producir un espectro MS/MS mixto. El mapa de oligonucleótidos emplea una ventana de aislamiento de MS/MS (1,5 m/z) que equilibra la necesidad de minimizar la incidencia de espectros mixtos (Fig. 5B y C) y muestra la distribución isotópica para permitir la determinación del estado de carga de iones de fragmentos. Los isómeros de secuencia "1" y "2" son muy similares y solo difieren en un único intercambio de los nucleótidos tercero y sexto (Fig. 5C). Por lo tanto, sus espectros MS/MS son muy similares, pero unos pocos iones de fragmentos clave distinguen cada isómero de secuencia.

La fragmentación e interpretación adecuada de MS/MS es fundamental para el mapeo de oligonucleótidos. (A) Cromatograma de iones extraídos de 3 isómeros de secuencia de oligonucleótidos ([M-4H]4-). (B) Espectros de masas de barrido completo de los isómeros de secuencia "1" y "2" ([M-4H]4-) como se indica en el panel (A). El sombreado azul define la ventana de aislamiento de precursores utilizada para la posterior fragmentación de MS/MS. (C) Espectros de fragmentación MS/MS derivados de los isómeros de secuencia "1" y "2" ([M-4H]4−). (D) Secciones ampliadas de isómeros de secuencia "1" y "2" ([M-4H]4−) en espectros de MS/MS, con anotación de iones de fragmentos 5' y 3' seleccionados. Las columnas 1.ª, 2.ª y 3.ª en el panel de fragmentos de MS/MS de 5′ observados (superior) resaltan los fragmentos de 5′ identificados para las posiciones 2, 3 y 6, respectivamente. Las columnas 1.ª, 2.ª y 3.ª del panel de fragmentos de MS/MS 3' observados (abajo) resaltan los fragmentos 3' identificados para las posiciones 1, 2 y 5, respectivamente. Para cada panel, la etiqueta "divergente" indica que las masas de los mismos iones de fragmento entre las secuencias de isómeros "1" y "2" divergen en esa posición, lo que indica que contienen diferentes nucleótidos en esa posición. La etiqueta "convergente" indica que las masas del mismo fragmento de iones entre las secuencias de isómeros "1" y "2" convergen en esa posición, lo que nuevamente indica que contienen diferentes nucleótidos en esa posición. La codificación por colores de los picos espectrales se define en la clave. El sombreado de color único de cada flecha que resalta los iones del fragmento corresponde a los colores definidos en el panel (E). (E) Tablas de masa de iones de fragmentos observados para los isómeros de secuencia "1" y "2" ([M-4H]4−). El sombreado de color único define cada tipo de ion de fragmento 5 'y su par 3' y coincide con las flechas sombreadas en el panel (D). El sombreado azul oscuro resalta las dos bases que cambian de posición entre los dos isómeros de secuencia. El sombreado gris resalta las masas de iones de fragmentos que diferencian los dos isómeros de secuencia entre sí.

Al leer desde el extremo 5 '(Fig. 5D y E), los iones del fragmento terminal que terminan en las posiciones 1 y 2 tienen masas idénticas para cada isómero de secuencia. Los iones de fragmentos terminales que terminan en las posiciones 3 a 5 tienen masas únicas y divergentes en cada isómero de secuencia, lo que indica una diferencia en la secuencia en la posición 3. Los iones de fragmentos terminales que terminan en la posición 6 convergen en masa, lo que indica otra diferencia en la secuencia entre los isómeros de secuencia en la posición 6 .

Al leer desde el extremo 3 '(Fig. 5D y E), los iones del fragmento terminal en la posición 1 tienen masas idénticas para cada isómero de secuencia. Los iones de fragmentos terminales que terminan en las posiciones 2 a 4 tienen masas únicas para cada isómero de secuencia, lo que indica una diferencia en la secuencia en la posición 2. Los iones de fragmentos terminales que terminan en la posición 5 convergen en masa, lo que indica otra diferencia entre los isómeros de secuencia en la posición 5.

En ambos casos, la detección de diferencias de secuencia se basa en tener una escalera de iones de fragmentos completa. La fragmentación MS/MS por mapeo de oligonucleótidos produjo escaleras de iones de fragmentos complementarios completos para la mayoría de los isómeros de secuencia, lo que permitió su identificación inequívoca y atestiguó la idoneidad de los parámetros para el mapeo de oligonucleótidos.

El análisis completo y de alta fidelidad de los datos de mapeo de oligonucleótidos requiere automatización para lograr una eficiencia y una facilidad de uso prácticas. Se utilizaron secuencias de comandos internas de Excel Visual Basic para aplicaciones (VBA) combinadas con software beta y de proveedores comerciales en desarrollo para automatizar el análisis de datos del mapeo de oligonucleótidos. Juntas, estas herramientas facilitaron la caracterización integral de la estructura primaria de BNT162b2 Original a través del mapeo de oligonucleótidos con anotación completa de picos UV y cobertura de secuencia máxima del 100 %.

Un script personalizado de Excel VBA correlacionó automáticamente los oligonucleótidos identificados por LC-MS/MS con su función LC-UV correspondiente y anotó automáticamente todo el cromatograma UV (datos complementarios, la Fig. 6 ilustra todo el flujo de trabajo). Las identificaciones se proporcionaron mediante uno de dos métodos: (1) 280 de 388 (72 %) oligonucleótidos se identificaron mediante BioPharma Finder (Thermo Fisher Scientific), (2) 108 de 388 (28 %) se identificaron mediante scripts Excel VBA personalizados. Los scripts facilitaron la identificación semiautomática de oligonucleótidos mediante el siguiente procedimiento: (1) las masas precursoras observadas asociadas con características LC-UV no identificadas se compararon con posibles oligonucleótidos de digestión teóricos, (2) para cada pico empírico MS/MS m/z desconocido las coordenadas de intensidad, la masa observada, el estado de carga y un oligonucleótido hipotético de la lista de candidatos se ingresaron en un analizador de espectro MS/MS, (3) se generaron automáticamente un espectro MS/MS anotado y la tabla de secuenciación correspondiente, (4) el MS/ Un analista revisó la secuencia de MS para el oligonucleótido hipotético, confirmando o rechazando la identificación.

El análisis de datos de mapeo de oligonucleótidos se ve desafiado por la abundancia de secuencias de isómeros que tienen espectros MS/MS muy similares. También existe una alta probabilidad de que muchos de los productos de digestión con RNasa T1 para una construcción diana grande (por ejemplo, ~ 1 + MDa) tengan masas idénticas y una gran similitud de secuencia con los productos de digestión de otras construcciones con tamaño y composición similares. Por ejemplo, la secuencia inversa de BNT162b2 tiene el mismo número de productos de digestión con RNasa T1 in silico que la secuencia directa; pero solo el 26% de ellos tienen la misma secuencia (Fig. 6A). Sin embargo, el 99 % tiene la misma masa (Fig. 6B), lo que hace que la MS/MS de alta calidad y la interpretación de alta fidelidad de esos espectros sean fundamentales para su identificación y la identificación de la construcción correcta.

Técnica de búsqueda de secuencias señuelo desarrollada como una evaluación de idoneidad para el flujo de trabajo de mapeo de oligonucleótidos. (A) Diagrama de Venn de los fragmentos de oligonucleótidos únicos y compartidos de una digestión teórica con RNasa T1 de la construcción original BNT162b2 y su construcción de secuencia inversa. Este es un ejemplo de una construcción señuelo. La digestión teórica predice 302 oligonucleótidos de secuencia única (74 %) para cada uno y 78 oligonucleótidos compartidos (26 %). (B) Diagrama de Venn de los fragmentos de oligonucleótidos de masa única y masa compartida de una digestión teórica con RNasa T1 de la construcción original BNT162b2 y de su construcción de secuencia de reserva. La digestión teórica predice 147 oligonucleótidos de masa única para cada uno. De estos, se comparten 145 oligonucleótidos (99%). (C) Superposición de identificación de construcción de señuelo en el cromatograma de iones de pico base de la adquisición de digestión BNT162b2 Original RNase T1. Cada barra coloreada marca una característica de oligonucleótido identificada por el software automatizado BioPharma Finder como originada en la digestión de RNase T1 de una construcción señuelo. Las construcciones señuelo son secuencias aleatorias que contienen la composición de nucleótidos de BNT162b2 Original. La región de elución de secuencia común contiene oligonucleótidos más cortos, la mayoría de los cuales son comunes a cualquier construcción señuelo, así como a la construcción verdadera cuando se somete a digestión con RNaseT1. La región de elución de secuencia única contiene oligonucleótidos más largos, la mayoría de los cuales son exclusivos de la construcción verdadera. Los oligonucleótidos de construcción verdaderos son lo suficientemente similares como para señuelo de secuencia de oligonucleótidos para que el software automatizado proporcione asignaciones de oligonucleótidos de señuelo. Las identificaciones en la región de elución de secuencia única no se asignan preferentemente a una sola construcción señuelo, lo que demuestra que ninguna de las construcciones señuelo es la verdadera construcción. (D) Superposición de identificación de construcción objetivo y señuelo en el cromatograma de iones de pico base de la adquisición de digestión BNT162b2 Original RNase T1. Cada barra de color marca una característica de oligonucleótido identificada por el software automatizado BioPharma Finder como originada en la digestión de RNasa T1 de una construcción de señuelo o objetivo. Los oligonucleótidos en la región de elución de secuencia única se identifican principalmente (> 95 %) como pertenecientes a la construcción original BNT162b2. Esto confirma la identidad del verdadero constructo y verifica la capacidad del flujo de trabajo de mapeo de oligonucleótidos para identificar correctamente los oligonucleótidos a través de LC-MS/MS.

Debido a este desafío, es necesaria una evaluación de idoneidad realizada a escala integral para el análisis automatizado de datos de oligonucleótidos. El primer paso de la estrategia también ilustra el problema inherente. La identificación automatizada de los oligonucleótidos BNT162b2 se realiza contra construcciones señuelo generadas codificando aleatoriamente la secuencia (Fig. 6C). La mayoría de los oligonucleótidos que eluyen en la "región de secuencia única" solo se pueden generar a través de la digestión con RNasa T1 de la construcción verdadera, a diferencia de los oligonucleótidos de la "región de secuencia común" que son comunes a las digestiones in silico de la construcción verdadera y una o más construcciones señuelo. . Muchos oligonucleótidos únicos son similares a los oligonucleótidos de digestión con RNasa T1 in silico de una o más construcciones señuelo, de modo que el software asigna debidamente una identificación (aunque incorrectamente). Esto ocurre porque se cumple el criterio de coincidencia de iones precursores de MS y hay suficiente evidencia de MS/MS para respaldar una identificación de secuencia razonable. Es importante destacar que la omisión de la construcción BNT162b2 de la búsqueda de señuelo (Fig. 6C) da como resultado que los oligonucleótidos se asignen a una mezcla comparable de las tres construcciones de señuelo. Por el contrario, la mayoría de los oligonucleótidos en la "región de secuencia única" se asignan a la construcción BNT162b2 cuando se buscan junto con las construcciones señuelo, lo que revela que es la construcción verdadera (Fig. 6D). Esta lectura es una validación de que el flujo de trabajo combinado de (1) digestión enzimática de una enzima en un recipiente, (2) separación cromatográfica, (3) fragmentación de MS/MS HCD y (4) análisis de datos semiautomático es adecuado para ARNm caracterización de la estructura primaria.

Si bien el software automatizado utilizado en este estudio, BioPharma Finder, permite verificar la fidelidad general mediante la búsqueda de señuelos, para las coincidencias individuales de MS/MS no proporciona una clasificación de las mejores y las siguientes mejores coincidencias, ni una probabilidad coincidente derivada de su puntaje de confianza. Para cotejar las asignaciones individuales de MS/MS, también hemos utilizado el paquete de software Pytheas disponible públicamente32. En esta comparación, no fue posible hacer coincidir las coincidencias de espectro de un solo fragmento entre el software; en cambio, se compararon los tiempos de retención de las identificaciones del mismo oligonucleótido. Los tiempos de retención no coinciden perfectamente porque Pytheas solo interpreta MS/MS, de modo que el tiempo de retención de una identificación se basa en su tiempo de evento de escaneo MS/MS, mientras que BioPharma Finder extrae cromatogramas de iones precursores y asocia una identificación MS/MS con el tiempo de retención del ápice del ion precursor extraído. Sin embargo, el coeficiente de correlación de 0,9997 y la pendiente de 0,9993 del ajuste lineal a la gráfica de los tiempos de retención (Pytheas, BioPharma Finder) de los 280 oligonucleótidos identificados por BioPharma Finder demuestra que ambos programas coinciden con casi todas las identificaciones de oligonucleótidos (datos complementarios, figura 7). Este análisis plantea una observación importante: cuando las características de LC no están compuestas por isómeros de secuencia, el software automatizado BioPharma Finder y Pytheas identifican los oligonucleótidos igualmente bien. Cuando las características de LC son picos de mezcla de isómeros de secuencia, ningún software identifica bien los oligonucleótidos (la característica no está identificada (BioPharma Finder) o está identificada incorrectamente (Pytheas)), y el analista debe rescatar la identificación mediante una interpretación cuidadosa del espectro utilizando un software de coincidencia de espectro individual como como las hojas de cálculo habilitadas para macros de Excel proporcionadas en este estudio.

El mapeo de oligonucleótidos LC-MS/MS se desarrolló para proporcionar una caracterización directa e integral de la estructura primaria del ARNm para la vacuna Comirnaty BNT162b2 contra el SARS-CoV-2. Utilizando una enzima, la RNasa T1, el método logró una cobertura de secuencia máxima del 100 % y una detección sensible de las formas terminales 5′ y 3′, lo que confirma la integridad estructural de la molécula de longitud completa prevista en un solo método. El número de repeticiones de secuencias de oligonucleótidos en el ARNm prevalece después de la digestión con RNasa T1, pero el método digirió y detectó estequiométricamente estas especies, aumentando la cobertura de secuencia única del 56 %. La evaluación sistemática de los parámetros MS/MS condujo a una diferenciación fiable de los isómeros de secuencia, que también prevalecen en el ARNm digerido, para un mayor aumento de la cobertura máxima de secuencia. Por último, se desarrolló una técnica de búsqueda de análisis de datos de secuencia de señuelo para garantizar la confianza en la asignación automatizada de oligonucleótidos. En conjunto, el método de mapeo de oligonucleótidos LC-MS/MS descrito aquí mejora los métodos existentes al (1) proporcionar un método sólido de digestión con nucleasa comercialmente disponible en un solo recipiente; (2) garantizar que se adquieran los MS/MS con mayor información de secuenciación utilizando fragmentación HCD optimizada; (3) proporcionar una evaluación de idoneidad de búsqueda de señuelo simple para garantizar que el software automatizado interprete correctamente MS/MS; (4) proporcionar una herramienta para permitir la anotación adecuada del cromatograma LC-UV complejo de "huella digital" y (5) proporcionar herramientas de interpretación de espectro MS y MS/MS para verificar identificaciones de software automatizadas e identificar picos de mezcla de isómeros desconocidos y de secuencia.

Recomendamos una evaluación de idoneidad práctica para evaluar todo el flujo de trabajo de LC-MS/MS, incluido el análisis de datos automatizado (Fig. 6C y D). Esta estrategia de búsqueda de señuelo es análoga a lo que se ha realizado durante mucho tiempo para la inferencia de proteínas en los análisis proteómicos33. Este método de mapeo de oligonucleótidos no es un método "ómico"; independientemente de la heterogeneidad de los extremos 3' y 5', DS es una construcción única, no una mezcla compleja de miles de moléculas de ARN. Sin embargo, la búsqueda de señuelos que permite la evaluación de la calidad de coincidencia de MS/MS a través de la comparación espectral relativa es apropiada, porque los isómeros de secuencia de la misma construcción pueden tener patrones de fragmentación muy similares, y hay muchos isómeros de secuencia: 220 de los 302 BNT162b2 ARNm teórico RNasa T1 digerir oligonucleótidos.

Otro aspecto prometedor de este enfoque de MS es que, al caracterizar directamente el ARN, los sitios de degradación por hidrólisis de fosfodiéster y los sitios de transcripción incompleta también pueden catalogarse y monitorearse posteriormente para comprender las vías de degradación de DS. Además, es posible detectar oligonucleótidos que surgen de la transcripción de la región no objetivo del plásmido de ADN (aunque esto no se observó en este estudio). Por último, este método de mapeo de oligonucleótidos podría optimizarse aún más y aplicarse para caracterizar las modificaciones específicas del sitio, incluidos los aductos de ARNm-lípidos34 y otros posibles efectos.

Hay otras buenas estrategias para aumentar el número de oligonocleótidos únicos en el mapa de ARN, ya sea promoviendo escisiones perdidas de RNase T1 en una digestión limitada o usando endonucleasas con sitios de sustrato de baja frecuencia, como MazF y RNase 418,19,35. La metodología de análisis de datos que se detalla aquí debería funcionar igual de bien y, además, puede ser necesaria, ya que la identificación de los componentes de los picos de mezcla es un problema independiente de la singularidad de los oligonucleótidos (aunque debería haber menos picos de mezcla).

El mapeo de oligonucleótidos y la secuenciación de próxima generación (NGS) son métodos de caracterización ortogonal potentes para la determinación de la estructura primaria del ARNm. Ambas técnicas tienen claras ventajas. NGS puede determinar de manera efectiva la secuencia de nucleótidos contigua con múltiples lecturas (Datos complementarios Fig. 8), así como también detectar e identificar cualquier ADN/ARN contaminante. El mapeo de oligonucleótidos se utiliza para confirmar la integridad estructural de toda la molécula de ARNm, incluida la secuencia de nucleótidos, el grado de terminal 5' con o sin caperuza y la microheterogeneidad de la región de la cola poli(A). También agrega una capacidad vital para evaluar la comparabilidad de los lotes después de cambios en el proceso de fabricación y el sitio. Puede usarse para distinguir diferentes construcciones de ARNm como un ensayo de identidad. No es necesario sintetizar ni mantener controles específicos del método (como los controles marcados con isótopos pesados).

El método de mapeo de oligonucleótidos descrito aquí que implica 1,5 h de digestión con RNasa T1 e IP-RP-UHPLC-UV-MS/MS se utilizó en el desarrollo y comercialización de la vacuna Comirnaty BNT162b2 contra el SARS-CoV-2. La comprensión del proceso y del producto obtenida del mapeo de oligonucleótidos apoyó las presentaciones regulatorias de la autorización de uso de emergencia (EUA) y la solicitud de licencia biológica (BLA) y contribuyó a la evaluación general de la calidad, seguridad y eficacia del producto. Del mismo modo, el mapeo de oligonucleótidos ha sido parte de muchos ejercicios de comparabilidad que ayudan a demostrar que se mantuvo la más alta calidad del producto a medida que aumentaban las escalas de producción y se ponían en línea nuevos sitios de fabricación para enfrentar el desafío crítico de suministro de la pandemia de COVID-19. Nuestra intención es que este método acelere el desarrollo y las presentaciones reglamentarias de vacunas de ARNm bien caracterizadas y terapias genéticas y avance la ciencia de la comprensión estructural del ARN de manera más amplia.

Los datos sin procesar y un documento detallado del método se proporcionan en Dryad Data Platform: https://datadryad.org/stash/share/38WoZ944MVcISX-VQpGNoaXn_4Pwe5nv_ipD707TZF8.

En la plataforma de datos Dryad se proporcionan cuatro herramientas de identificación y mapeo de software Excel VBA que se utilizan para verificar y aumentar las identificaciones de Thermo BioPharma Finder y proporcionar un cromatograma anotado: https://datadryad.org/stash/share/38WoZ944MVcISX-VQpGNoaXn_4Pwe5nv_ipD707TZF8. El documento de método provisto también describe las instrucciones clic por clic para el uso de cada archivo.xlsm.

Las construcciones de ARNm analizadas se fabricaron en Pfizer. Aunque las secuencias se proporcionan en este manuscrito, no es posible poner a disposición ninguno de los materiales de ARNm presentados aquí.

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Descargar referencias

Los autores agradecen a nuestros socios de BioNTech, Andreas Kuhn y Julia Schlereth, por su apoyo y comunicación. Agradecemos a Jennifer Sutton, nuestra socia desde hace mucho tiempo en Thermo, por permitirnos colaborar en el desarrollo del módulo de análisis de oligonucleótidos de BioPharma Finder. Damos las gracias a Taylor Dufield para las contribuciones de optimización de métodos. Agradecemos a Erika Jensen y Mojgan Kouhnavard por su trabajo midiendo el coeficiente de extinción de N1-metilpseudouridina. Por último, agradecemos al liderazgo de Pfizer, Jeff Ryczek, Lisa Marzilli, Justin Sperry y Margaret Ruesch, por su apoyo y asesoramiento durante el desarrollo y la aplicación de este método.

Estos autores contribuyeron por igual: Brian C. Gau y Andrew W. Dawdy.

BioTherapeutics Ciencias Farmacéuticas, Pfizer Inc, Chesterfield, MO, EE. UU.

Brian C. Gau, Andrew W. Dawdy, Hanliu Leah Wang, Bradley Bare, Carlos H. Castaneda, Olga V. Friese y Thomas F. Lerch

BioTherapeutics Ciencias Farmacéuticas, Pfizer Inc, Andover, MA, EE. UU.

Matthew S. Thompson, David J. Cirelli y Jason C. Rouse

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AD y BG contribuyeron por igual a este trabajo, y la correspondencia también puede dirigirse a uno o ambos autores. Los autores desean que se sepa que, en su opinión, los 2 primeros autores deben ser considerados como Primeros Autores conjuntos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Brian C. Gau o Andrew W. Dawdy.

Todos los autores son empleados de Pfizer.

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Reimpresiones y permisos

Gau, BC, Dawdy, AW, Wang, HL et al. Mapeo de oligonucleótidos a través de espectrometría de masas para permitir la caracterización integral de la estructura primaria de una vacuna de ARNm contra el SARS-CoV-2. Informe científico 13, 9038 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36193-2

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Recibido: 17 de marzo de 2023

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 03 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36193-2

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