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Jan 27, 2024

El análisis multiómico muestra que los lisosomas necesitan retromer para mantenerse saludables

9 de junio de 2023 El complejo retrómero controla la clasificación, el transporte y la

09 jun 2023

El complejo retrómero controla la clasificación, el transporte y la eliminación de proteínas a través del sistema de endolisosomas. Va mal en las enfermedades neurodegenerativas, pero no está claro cómo. El metabolismo se descompone en las células que carecen de retrómero, según un estudio multiómico dirigido por Peter Cullen y James Daly en la Universidad de Bristol del Reino Unido. En Nature Communications del 29 de mayo, informaron que las proteínas de la membrana celular están mal clasificadas, los lisosomas se hinchan con carga no digerida, la autofagia se detiene y la proteína precursora amiloide se acumula. Esta copia de seguridad hace que los lisosomas descarguen el exceso de contenido fuera de la célula a través de la exocitosis, lo que podría permitir la propagación de proteínas patógenas de célula a célula, como los agregados de Aβ.

"Hay pruebas claras que vinculan al retrómero con una función neuroprotectora en las enfermedades neurodegenerativas. Este manuscrito investiga la complejidad de la función del retrómero y cómo ayuda en la neuroprotección", dijo Cullen a Alzforum.

"Este nuevo y emocionante trabajo del grupo Cullen acaba de dar grandes pasos para descubrir estos mecanismos", comentó Jessica Young, de la Universidad de Washington, Seattle.

Retromer regula el reciclaje endosómico a la superficie celular y su movimiento retrógrado al aparato de Golgi. Las mutaciones en la proteína retromérica central VPS35 se han relacionado con la EA y la enfermedad de Parkinson (Rovelet-Lecrux et al., 2015; noticias de julio de 2011). Retromer se agota en el cerebro con AD, post mortem, mientras que en modelos celulares y animales la deficiencia del complejo se correlaciona con una peor patología de Aβ y tau (Small et al., 2005; Sullivan et al., 2011; Carosi et al., 2020).

Para estudiar sistemáticamente lo que sale mal cuando se desactiva el retrómero, los coautores Daly y Chris Danson eliminaron VPS35 en células de neuroglioma humano, luego tiñeron los lisosomas con LAMP1 y los endosomas tempranos con EEA1. Ambos orgánulos se habían hinchado y distorsionado en las células knockout. La microscopía electrónica de transmisión mostró endolisosomas agrandados rellenos con trozos de membrana no digeridos (ver imagen a continuación). Este último recordaba a los endolisosomas hinchados en la EA, la EP y la demencia con cuerpos de Lewy (Cataldo et al., 2000; Shahmoradian et al., 2019; Crews et al., 2010).

Cullen, y la comentarista Julia TCW de la Universidad de Boston, se sorprendieron de que apuntar a una sola proteína retrómera pudiera causar un fenotipo tan llamativo. Las imágenes de células vivas de los knockouts capturaron la división ocasional y lenta de grandes lisosomas autofágicos. Este proceso devuelve los orgánulos a su tamaño original, lo que explica los numerosos orgánulos hinchados.

Endolisosomas agrandados . Los lisosomas normales (flechas rojas) y los endosomas (flechas azules) son pequeños y redondos (izquierda). Las células de retromer knockout (centro) contenían enormes endolisosomas distorsionados (flechas amarillas) llenos de desechos (derecha). [Cortesía de Daly et al., Nature Communications, 2023.]

¿Qué estaba fallando dentro de estos lisosomas? Los científicos analizaron proteomas de células enteras y de lisosomas aislados. Dentro del primero, 477 proteínas asociadas a lisosomas se enriquecieron y 246 se agotaron. Muchas enzimas hidrolíticas, como proteasas, lipasas y nucleasas, se redujeron, lo que sugiere una capacidad atrofiada para degradar los desechos celulares.

Los lisosomas negativos para VSP35 se apilaron con múltiples Rab GTPasas hidrolíticas, que regulan la exocitosis lisosomal y su fusión con endosomas y autosomas. El proteoma lisosomal también carecía de todos los componentes del complejo BORC, proteínas que mueven los orgánulos a través del citosol al adherirse a los microtúbulos.

Dimitrios Kapogiannis estaba particularmente intrigado por la acumulación de proteínas involucradas en el procesamiento y metabolismo de APP (comentario a continuación). Esto refleja un hallazgo observado en ratones que carecen de VPS35 en las neuronas del hipocampo (noticias de enero de 2022).

Otras proteínas lisosomales enriquecidas asignadas a redes y vías de señalización implicadas en la EA, la EP y otras enfermedades neurodegenerativas (imagen a continuación). Para los autores, estos resultados sugieren lisosomas llenos de APP estancados que se fusionaron con endo y autosomas pero que no degradaron su contenido ni regresaron a su estado original.

Enfermedades Enfermedades. Muchas proteínas enriquecidas en lisosomas caen en vías asociadas con enfermedades neurodegenerativas o procesos relacionados. [Cortesía de Daly et al., Nature Communications, 2023.]

Los lisosomas estancados incluso afectaron al proteoma de la superficie celular. En los knockouts de VSP35, las proteínas transmembrana se agotaron donde pertenecen, en la membrana, pero se enriquecieron en lisosomas, lo que sugiere que el reciclaje de proteínas de membrana se había retrasado. Por otro lado, las proteínas lisosomales, como LAMP1 y el transportador de colesterol unido a Nieman Pick Tipo C NPCI, se agruparon en la superficie celular, al igual que APP, β-secretasa 2 y los fragmentos C-terminales de APP que produce BACE. Los autores creen que estos cambios en el lugar donde terminan las proteínas en la célula indican exocitosis de lisosomas.

De hecho, la medición del proteoma de los medios celulares reveló altos niveles de proteínas lisosomales, APP y otros sustratos de secretasas. Los autores sospechan que la exocitosis de los lisosomas aumenta para compensar la acumulación de desechos. Esto, a su vez, podría impulsar la propagación de células patógenas de agregados de proteínas. Los científicos creen que las proteínas de este "secretoma" podrían ser biomarcadores fluidos para la disfunción de los lisosomas (consulte las noticias de diciembre de 2020). "Estos datos sugieren una mayor secreción no solo de los lisosomas, sino también de las vesículas extracelulares convencionales y los intermediarios autofagosomales", señaló Tsuneya Ikezu, de Mayo Clinic, Jacksonville, Florida (comentario a continuación).

Scott Small de la Universidad de Columbia, Nueva York, cree que el secretoma puede informar sobre la diafonía entre las células. "Creo que el secretoma es el más relevante para las enfermedades neurodegenerativas porque los contenidos endo-lisosomales expulsados ​​de las neuronas iniciarían la comunicación con la microglía y los astrocitos, y sabemos cómo esto a veces puede ser contraproducente", dijo Small.

ARN versus proteína. Solo 14 proteínas (texto azul) se regularon hacia abajo o hacia arriba en los niveles transcriptómicos y proteómicos en células completas. [Cortesía de Daly et al., Nature Communications, 2023.]

La transcriptómica reveló una desconexión entre la expresión génica y la concentración de proteínas. De los cientos de proteínas perturbadas en los knockouts de VPS35, solo 14 se regularon hacia arriba o hacia abajo a nivel transcripcional (imagen de arriba). Esto sorprendió a Cullen. La proteómica y la transcriptómica no siempre se correlacionan estrechamente. Cullen cree que la desconexión aquí indica que los problemas causados ​​por la desactivación del retrómero radican en la degradación de proteínas, no en la transcripción. El hecho de que los genes que codifican proteínas lisosomales, como el receptor de membrana sortilina, NPC1 y la proteasa catepsina D, aumentaran a pesar de no aparecer en los lisosomas sugiere problemas con el tráfico de proteínas.

Todos los cambios morfológicos, proteómicos y transcriptómicos en los endolisosomas de retromer knockout se revirtieron una vez que se volvió a expresar VPS35. "Esto nos dice que los cambios que estamos viendo son un fiel reflejo de un efecto en el objetivo de la perturbación del retrómero", dijo Cullen.

En opinión de TCW, esto hace que el retrómero sea interesante como diana farmacológica. "Muchas moléculas pequeñas activan la función de retromer, y será importante descubrir las proteínas o los factores de transcripción ascendentes y descendentes clave que impulsan la función de retromer", dijo a Alzforum (ver noticias de enero de 2020).—Chelsea Weidman Burke

Hace mucho tiempo que se conoce la asociación del complejo de clasificación de múltiples proteínas, retromer, con trastornos neurodegenerativos, como la EA y la PD. Sin embargo, la inmensa complejidad de la vía dificulta la disección de los mecanismos de esta asociación.

Este nuevo y emocionante trabajo del grupo Cullen acaba de dar grandes pasos para descubrir estos mecanismos. Mediante el uso de células VPS35 KO y la inmunoprecipitación lisosomal, han detallado meticulosamente los cambios en las proteínas asociadas con los orgánulos endo-lisosomales y la superficie celular. Los datos indican que la pérdida de retromer podría promover el estrés celular, lo que lleva a la neurodegeneración por falla en la resolución de la dinámica de la membrana del lisosoma y un aumento en la exocitosis lisosomal. Esto podría liberar proteínas potencialmente patógenas fuera de la célula donde pueden generar agregación en las células vecinas.

Sorprendentemente, sus datos también indican un papel para el retrómero en la regulación de la identidad lisosomal que, cuando no se adquiere adecuadamente, puede cambiar los programas metabólicos celulares. Varios estudios han utilizado chaperonas retrómeras de molécula pequeña para mejorar los fenotipos de EA (Mecozzi et al, 2014; Young et al., 2018; Mishra et al., 2022). Una comprensión más completa de los intrincados procesos regulados por retromer en la célula sin duda ayudará en los estudios destinados a abordar terapéuticamente esta vía.

Mecozzi VJ, Berman DE, Simoes S, Vetanovetz C, Awal MR, Patel VM, Schneider RT, Petsko GA, Ringe D, Small SA. Las chaperonas farmacológicas estabilizan el retrómero para limitar el procesamiento de APP . Nat Chem Biol. 2014 junio; 10 (6): 443-9. Epub 2014 20 de abril PubMed.

Young JE, Fong LK, Frankowski H, Petsko GA, Small SA, Goldstein LS. La estabilización del complejo retromer en un modelo de células madre humanas de la enfermedad de Alzheimer reduce la fosforilación de TAU independientemente de la proteína precursora amiloide . Informes de células madre. 13 de marzo de 2018; 10 (3): 1046-1058. Epub 2018 1 de marzo PubMed.

Mishra S, Knupp A, Kinoshita C, Martinez R, Theofilas P, Young JE. La estabilización farmacológica de retromer rescata la patología endosomal inducida por defectos en el gen SORL1 del Alzheimer.2022 02 de agosto 10.1101/2022.07.31.502217 (versión 1) bioRxiv.

Se han implicado anomalías retroméricas en la patogenia de la enfermedad de Alzheimer, pero los mecanismos exactos siguen sin estar claros. Este nuevo estudio de Daly et al. ofrece nuevos conocimientos valiosos al vincular retromer con la salud del sistema endo-lisosomal; Específicamente, el estudio muestra cómo las células de neuroglioma H4 eliminadas por el componente central VPS35 de Retromer manifiestan una variedad de cambios morfológicos en el sistema endo-lisosomal que se asemejan a los observados en la EA.

Estoy particularmente intrigado por el hallazgo proteómico de enriquecimiento de proteínas involucradas en el procesamiento de APP, incluida una acumulación de APP en los lisosomas VPS35 KO, así como una acumulación anormal de APP escindida, lo que sugiere que las anomalías del retrómero pueden estar aguas arriba de la acumulación de Aβ.

Sin embargo, el estudio tiene sus limitaciones, especialmente, el hecho de que el modelo principal es una línea celular neoplásica, que puede no recapitular completamente los eventos en las neuronas normales (aunque los autores intentaron establecer la relevancia fisiológica de su modelo utilizando neuronas primarias de la corteza de ratón). transfectados con plásmidos de miRNA Vps35-BFP y observaron cambios morfológicos similares).

También siento que se perdió una oportunidad al no aislar las vesículas extracelulares del sobrenadante del cultivo y analizar su proteoma. Dado que se identificaron muchas proteínas exosómicas mediante el análisis proteómico de este sobrenadante, habría sido informativo saber qué proteínas están asociadas a EV y cuáles no.

En general, este es un estudio interesante y potencialmente impactante que proporciona nuevos conocimientos y motiva hipótesis novedosas.

Este es un estudio muy completo basado en células que utiliza enfoques multiómicos para comprender cómo la deficiencia de Vps35 conduce a la acumulación de componentes lisosomales. El uso de Tmem192 etiquetado con HA para el etiquetado lisosomal para realizar LysoIP es un enfoque novedoso que, junto con la proteómica convencional de células completas, la transcriptómica y la proteómica de proteínas biotiniladas en la superficie celular y en el "secretoma" del medio de crecimiento, nos proporciona un conjunto de datos masivo para el análisis integrado basado en ómicas.

Entre muchos hallazgos fascinantes, fue muy interesante saber que Rab27b es una de las proteínas más significativamente enriquecidas en la célula y en los lisosomas. Rab27b es un regulador crítico para la secreción de vesículas extracelulares (EV) (Ostrowski et al., 2010) y también puede regular la secreción no exosomal de a-sinucleína (Underwood et al., 2020). Este estudio se centró en la acumulación lisosomal causada por la eliminación de Vps35, pero el conjunto de datos también muestra el enriquecimiento de los marcadores EV clásicos CD9 y CD81 en los lisosomas, CD9 en los medios de crecimiento y muchas otras tetraspaninas (TSPAN4, TSPAN6) en la superficie celular. Estos datos sugieren una mayor secreción no solo de los lisosomas, sino también de intermediarios EV y autofagosomales convencionales.

La composición proteica del lisosoma de las células Vps35 KO también muestra un enriquecimiento significativo de fragmentos C-terminales de APP y enzimas de procesamiento de APP, que también se encuentra en vehículos eléctricos derivados del cerebro (Perez-Gonzalez et al., 2012; Muraoka et al., 2020). ). TSPAN6 aumenta en el cerebro con enfermedad de Alzheimer y juega un papel en la clasificación del fragmento C-terminal a la secreción mediada por exosomas (Guix et al., 2017), y también puede estar involucrado en la acumulación del fragmento C-terminal en el lisosoma de células Vps35 KO. Teniendo en cuenta la sorprendente superposición de las proteínas patógenas que se encuentran en el lisosoma disfuncional y las neuritas distróficas, el estudio sugiere un papel fundamental para Vps35 en la formación de neuritas distróficas que rodean las placas amiloides, como se ve en modelos de amiloidosis en el cerebro humano con AD y en ratones.

Ostrowski M, Carmo NB, Krumeich S, Fanget I, Raposo G, Savina A, Moita CF, Schauer K, Hume AN, Freitas RP, Goud B, Benaroch P, Hacohen N, Fukuda M, Desnos C, Seabra MC, Darchen F , Amigorena S, Moita LF, Thery C.Rab27a y Rab27b controlan diferentes pasos de la vía de secreción de exosomas . biol celular nat. 2010 Ene;12(1):19-30; sup pp 1-13. Epub 2009 6 de diciembre PubMed.

Underwood R, Wang B, Carico C, Whitaker RH, Placzek WJ, Yacoubian TA. La GTPasa Rab27b regula la liberación, la eliminación autofágica y la toxicidad de la α-sinucleína . J Biol Chem. 5 de junio de 2020;295(23):8005-8016. Epub 2020 29 de abril PubMed.

Perez-Gonzalez R, Gauthier SA, Kumar A, Levy E. La vía secretora del exosoma transporta fragmentos carboxilo terminales de la proteína precursora amiloide desde la célula al espacio extracelular del cerebro . J Biol Chem. 2012 14 de diciembre; 287 (51): 43108-15. PubMed.

Muraoka S, DeLeo AM, Sethi MK, Yukawa-Takamatsu K, Yang Z, Ko J, Hogan JD, Ruan Z, You Y, Wang Y, Medalla M, Ikezu S, Chen M, Xia W, Gorantla S, Gendelman HE, Issadore D, Zaia J, Ikezu T. Perfiles proteómicos y biológicos de vesículas extracelulares de tejidos cerebrales humanos con enfermedad de Alzheimer . Demencia de Alzheimer. 2020 junio; 16 (6): 896-907. Epub 2020 17 de abril PubMed.

Guix FX, Sannerud R, Berditchevski F, Arranz AM, Horré K, Snellinx A, Thathiah A, Saido T, Saito T, Rajesh S, Overduin M, Kumar-Singh S, Radaelli E, Corthout N, Colombelli J, Tosi S, Munck S, Salas IH, Annaert W, De Strooper B. Tetraspanina 6: una proteína fundamental del cuerpo vesicular múltiple que determina la liberación de exosomas y la degradación lisosomal de fragmentos de proteínas precursoras de amiloide . Mol Neurodegener. 2017 10 de marzo; 12 (1): 25. PubMed.

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