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Jul 08, 2023

Explorando el papel potencial de las defensinas en la competencia de vectores diferenciales de los piojos del cuerpo y de la cabeza para Bartonella quintana

Parásitos y vectores

Parásitos y vectores volumen 16, Número de artículo: 183 (2023) Citar este artículo

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Los piojos del cuerpo y de la cabeza de los humanos son conespecíficos, pero solo el piojo del cuerpo funciona como vector para transmitir patógenos bacterianos como Bartonella quintana. Ambas subespecies de piojos tienen solo dos péptidos antimicrobianos, defensina 1 y defensina 2. En consecuencia, cualquier diferencia en las propiedades moleculares y funcionales de estas dos subespecies de piojos puede ser responsable de la competencia de vector diferencial entre ellos.

Para dilucidar la base molecular de la competencia del vector, comparamos las diferencias en las propiedades estructurales y los sitios de unión del factor de transcripción/microARN de las dos defensinas en los piojos del cuerpo y de la cabeza. Los espectros de actividad antimicrobiana también se investigaron utilizando defensinas de piojos recombinantes expresadas a través de baculovirus.

Las secuencias de aminoácidos completas de la defensina 1 eran idénticas en ambas subespecies, mientras que los dos residuos de aminoácidos de la defensina 2 eran diferentes entre las dos subespecies. Las defensinas de piojos recombinantes mostraron actividades antimicrobianas solo contra Staphylococcus aureus grampositivo representativo, pero no contra Escherichia coli gramnegativo ni contra la levadura Candida albicans. Sin embargo, mostraron una actividad considerable contra B. quintana, siendo la defensina 2 del piojo del cuerpo significativamente menos potente que la defensina 2 del piojo de la cabeza. sitios de unión a factores, pero un mayor número de sitios de unión a microARN, lo que sugiere actividades de transcripción relativamente más bajas de las defensinas de los piojos del cuerpo.

Las actividades antibacterianas significativamente más bajas de la defensina 2 junto con la menor probabilidad de expresión de defensina en los piojos del cuerpo probablemente contribuyan a la respuesta inmune relajada a la proliferación y viabilidad de B. quintana, lo que resulta en una mayor competencia de vector de los piojos del cuerpo en comparación con los piojos de la cabeza.

El piojo del cuerpo humano Pediculus humanus humanus y el piojo de la cabeza P. h. capitis son ectoparásitos hematófagos que pasan todo su ciclo de vida en huéspedes humanos y se alimentan de sangre humana. La infestación por piojos de la cabeza humana causa problemas económicos y sociales, mientras que la infestación por piojos del cuerpo humano amenaza la salud pública al transmitir enfermedades bacterianas [1]. Se cree que el piojo del cuerpo evolucionó a partir de un piojo de la cabeza conespecífico hace 40 000 a 70 000 años, cuando los humanos comenzaron a usar ropa [2], y posee una mayor competencia vectorial que el piojo de la cabeza. De estos dos tipos de piojos, solo se sabe que el piojo del cuerpo transmite patógenos bacterianos Gram-negativos, incluidos Bartonella quintana, Rickettsia prowazekii y Borrelia recurrentis, que causan fiebre de las trincheras, tifus epidémico y fiebre recurrente, respectivamente. Sin embargo, no se sabe que el piojo de la cabeza transmita enfermedades bacterianas a los humanos, probablemente debido a una mayor respuesta inmunitaria en comparación con el piojo del cuerpo [3,4,5].

Un análisis de todo el genoma de genes representativos relacionados con el sistema inmunológico tanto en el cuerpo como en los piojos de la cabeza reveló un conjunto compartido de 93 genes, lo que indica un sistema inmunológico significativamente reducido en los piojos humanos en comparación con otros insectos [3]. El número de genes asociados con el sistema inmunitario humoral se reduce sustancialmente en los piojos humanos, con algunos genes inmunitarios ausentes en el genoma del piojo humano [3, 6]. Se sugiere que este sistema inmunológico simplificado en los piojos humanos se debe a su ciclo de vida parasitario durante el cual se alimentan exclusivamente de sangre humana, y la sangre se considera una dieta relativamente estéril. Curiosamente, solo se han identificado dos péptidos antimicrobianos (AMP), a saber, la defensina 1 y la defensina 2, en los genomas de los piojos del cuerpo y de la cabeza de los seres humanos [3]. El análisis comparativo del transcriptoma reveló que tanto los piojos del cuerpo como los de la cabeza tienen prácticamente la misma base genética [7], lo que sugiere que las aparentes diferencias en la competencia de vectores entre estos dos tipos de piojos pueden deberse a los diferentes perfiles transcripcionales de los genes relacionados con el sistema inmunitario, como las defensinas. Se encontró que los niveles de transcripción basal tanto de la defensina 1 como de la defensina 2 eran significativamente más altos en el tejido del tracto alimentario de los piojos de la cabeza que en el de los piojos del cuerpo [4]. Además, la expresión de defensina 1 podría inducirse en los tejidos del tracto alimentario del piojo de la cabeza pero no en el piojo del cuerpo después de una exposición oral con B. quintana [5]. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que las respuestas inmunitarias mejoradas mediadas por la expresión constitutiva e inducible de las defensinas 1 y 2 contribuyen a la reducida competencia del vector en el piojo de la cabeza.

A pesar de la importancia de las defensinas de los piojos en las respuestas inmunitarias y la competencia de vectores en los piojos humanos, la información detallada sobre las propiedades estructurales y funciones de estos AMP es escasa. Queda por dilucidar cómo se regula diferencialmente la expresión de defensinas y si existe alguna diferencia en la actividad antimicrobiana de las defensinas entre el cuerpo y los piojos de la cabeza. Además, aún no se ha determinado la eficacia de las defensinas de los piojos frente a bacterias patógenas como B. quintana.

En este estudio, caracterizamos las propiedades moleculares y funcionales de las defensinas de los piojos. Los sitios potenciales de unión a factores de transcripción y sitios de unión de microARN (miARN) para las defensinas de los piojos se compararon entre los piojos del cuerpo y de la cabeza para dilucidar sus perfiles de expresión diferencial entre subespecies. Utilizando defensina 1 y defensina 2 recombinantes expresadas in vitro, se determinaron los espectros de actividad antimicrobiana de las defensinas de los piojos y se compararon entre los piojos del cuerpo y de la cabeza. Los datos presentados en este estudio deberían facilitar una comprensión profunda de la competencia vectorial diferencial mediada por las defensinas 1 y 2 entre los piojos del cuerpo y de la cabeza.

La cepa de piojo del cuerpo de San Francisco y la cepa de piojo de la cabeza del sur de Florida se criaron en un sistema de alimentación por membrana in vitro [8] en condiciones controladas de 30 °C, 70–80 % de humedad relativa y 16/8 h de luz/oscuridad. en cámaras de crianza (Junta de Revisión Institucional No. E2211/001–003).

Las secuencias de ADN complementario de defensina (ADNc) de piojos del cuerpo y de la cabeza se obtuvieron del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y de una publicación anterior [6], y se confirmaron por la clonación y resecuenciación de ADNc de la cepa de piojo del cuerpo de San Francisco y la cepa de piojo de la cabeza del sur de Florida. Las secuencias de aminoácidos de las defensinas de 38 especies de insectos se alinearon utilizando el paquete de análisis CLC Main Workbench 8 (CLC Bio, Waltham, MA, EE. UU.). Se construyó un árbol filogenético utilizando MEGA X (Pennsylvania State University, University Park, PA, EE. UU.) usando el método de máxima verosimilitud basado en el modelo Jones-Taylor-Thornton (JTT) con 1000 replicaciones bootstrap. El número en cada nodo del árbol indica el porcentaje de valores de arranque en función de 1000 pseudorreplicas. El modelado estructural tridimensional (3D) de las defensinas se llevó a cabo basándose en las estructuras de los péptidos defensina A de insectos [9] y defensina de Anopheles [10] en el banco de datos de proteínas. Las secuencias de los genes del piojo se enviaron al servidor de modelado molecular de SWISS-MODEL (servidor de modelado de proteínas comparativo automatizado) [11] para la predicción de la estructura, y las estructuras 3D se analizaron utilizando el programa UCSF Chimera [12]. El sitio de escisión del péptido señal, la hidrofobicidad, el peso molecular, el punto isoeléctrico (pI) y la carga neta a pH 7 se predijeron utilizando el servidor SignalP 6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP) [ 13], herramienta ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/) [14], herramienta Compute pI/MW (https://web.expasy.org/compute_pi/) [14] y calculadora de propiedades de péptidos ( https://pepcalc.com/), respectivamente. Los sitios de unión al factor de transcripción en la región 5' aguas arriba de los genes se predijeron utilizando el programa de descubrimiento de motivos PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/). La región reguladora putativa de 1000 pb del gen diana (secuencias de ADN genómico de 800 pb corriente arriba más 200 pb corriente abajo desde el sitio de inicio de la transcripción) se usó para la predicción del sitio de unión del factor de transcripción. Las secuencias se obtuvieron de la base del vector (http://www.vectorbase.org) y de los datos de secuenciación del genoma del piojo de la cabeza [6] para los piojos del cuerpo y de la cabeza, respectivamente. Las regiones 3' no traducidas (UTR) en las transcripciones de defensinas 1 y 2 del cuerpo y los piojos de la cabeza se usaron para la predicción de miARN utilizando la base de datos de secuencias de miARN miRBase (http://mirbase.org) [15]. El límite del valor E fue 10, y la base de datos de secuencias de miARN de artrópodos se utilizó para predicciones específicas.

El ARN total de cinco piojos del cuerpo y de la cabeza se extrajo utilizando 200 μl de reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para eliminar la contaminación de ADN del ARN total, se trató con ADNasa I (Takara Bio, Kyoto, Japón) y se sintetizó ADNc utilizando transcriptasa inversa SuperScript IV (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) con cebadores oligo dT. Las regiones del péptido señal y del péptido maduro de las defensinas 1 y 2 del piojo del cuerpo y la defensina 2 del piojo de la cabeza se amplificaron por separado usando cebadores específicos de genes (Archivo adicional 1: Tabla S1) con Advantage Taq (Clontech, Palo Alto, CA, EE. EE.UU). A continuación, estos se insertaron juntos en el vector pBacPAK8 (Clontech) con cebadores monocatenarios complementarios que contenían una His-Tag 6x. Las secuencias de plásmidos para cada paso de clonación se verificaron mediante secuenciación de ADN (Macrogen, Seúl, Corea). Los vectores de transferencia que contenían defensinas se cotransfectaron con ADN BacPAK6 (Clontech) en células Sf9 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) cultivadas en medio TC-100 (WelGENE, Gyeongsan, Corea) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (WelGENE) a 27 ° C (Archivo adicional 2: Tabla S2). Después de 5 días de transfección con el reactivo Bacfectin (Clontech), se recogió el sobrenadante de las células infectadas y se usó como reserva de virus. La primera reserva de virus se sembró en 5 × 106 células Sf9 y el sobrenadante se recogió después de 3 días de infección mediante centrifugación a 3300 rpm durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante se concentró utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 de 3 kDa (MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU.) mediante centrifugación a 7500 × g durante 40 min a 4 °C. El sobrenadante concentrado se cargó en una columna de afinidad HisTrap HP de 5 ml (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE. UU.) y se equilibró con un tampón de unión (NaH2PO4 50 mM y NaCl 300 mM que contenía imidazol 5 mM, pH 8,0) a un caudal de 5 ml/min usando AKTAprime más FPLC (GE Healthcare). La columna de afinidad HisTrap HP de 5 ml se lavó con 40 ml de tampón de lavado (NaH2PO4 50 mM y NaCl 300 mM que contenía imidazol 10 mM, pH 8,0) y se eluyó con tampón de elución (NaH2PO4 50 mM y NaCl 300 mM que contenía imidazol 250 mM, pH 8,0). Las fracciones con picos de elución se recolectaron y concentraron utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 de 3 kDa (MilliporeSigma) mediante centrifugación a 7500 × g durante 40 min a 4 °C, y el tampón se intercambió con Tris-HCl 100 mM (20 NaCl mM, pH 7,8) tampón para reducir la concentración de imidazol. La concentración de la muestra de péptido purificado se cuantificó utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), con albúmina de suero bovino como proteína estándar.

Se cultivaron Escherichia coli gramnegativa (Colección americana de cultivos tipo [ATCC] n.º 11775), Staphylococcus aureus grampositiva (ATCC n.º 12600) y Candida albicans de levadura grampositiva (ATCC n.º 10231) en caldo Luria-Bertani, caldo de infusión de cerebro y corazón y caldo de dextrosa de patata, respectivamente, a 200 rpm en una incubadora con agitación a 37 °C durante la noche, después de lo cual las bacterias cultivadas se diluyeron 100 veces en el mismo caldo de cultivo. Después de que la densidad óptica alcanzó 0,5 a 600 nm (OD600), se incubaron alícuotas de 10 μl de cada una de las defensinas recombinantes 1 y 2 a diversas concentraciones con 90 μl de cultivo bacteriano en una placa de 96 pocillos en una incubadora con agitación a 37 °C a 200 rpm durante la noche. El tampón Tris-HCl se utilizó como control negativo. Los valores de DO600 se midieron utilizando un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). La concentración inhibitoria media máxima (IC50) se calculó utilizando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.), y los ensayos de actividad antimicrobiana se realizaron con tres repeticiones.

La cepa de tipo salvaje B. quintana JK31, obtenida originalmente de la Dra. Jane Koehler (Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.), se mantuvo en una instalación de bioseguridad de nivel 2 en la Universidad Nacional de Seúl (LML08-1090). Se cultivaron stocks congelados de B. quintana en una placa de agar chocolate en un frasco de extinción de velas a 37 °C durante 10 días y se pasaron a una placa de agar fresco durante 7 días adicionales de cultivo. Las células cultivadas de B. quintana se recolectaron y se enjuagaron con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante centrifugación a 1000 × g durante 4 min. Después de dos enjuagues adicionales, los gránulos se volvieron a suspender en 100 μl de PBS. Se diluyeron en serie alícuotas de 5 μl de la suspensión bacteriana de 100 μl con PBS; luego se mezclaron completamente 12 μl de cada suspensión bacteriana diluida 1000 veces con 12 μl de gentamicina 100 μM como control positivo, tampón Tris-HCl 100 mM como control negativo y defensinas recombinantes 1 y 2 100 μM del piojo del cuerpo o defensina 2 del piojo de la cabeza. Se dejó caer un total de 8 μl de la mezcla en una placa de agar chocolate tres veces y se calculó el número de unidades formadoras de colonias (UFC) después de la incubación en un frasco de extinción de velas a 37 °C durante 10 días. El índice de colonias se obtuvo dividiendo UFC/μl por UFC/μl del control negativo.

Las actividades hemolíticas de las defensinas recombinantes 1 y 2 del piojo del cuerpo y la defensina 2 del piojo de la cabeza se evaluaron usando glóbulos rojos humanos (RBC) como se describió previamente [16]. Los glóbulos rojos se lavaron 3 veces con PBS durante 15 min a 960 rpm y luego se resuspendieron en PBS a una concentración del 2 %. Se incubaron alícuotas de 10 μl de defensinas recombinantes a cuatro concentraciones (10, 20, 50 y 100 μM) y antibióticos a cinco concentraciones (10, 20, 50, 100 y 200 μM) con 90 μl de glóbulos rojos durante 30 min a 37ºC. °C y se centrifugó durante 15 min a 960 rpm. La DO540 del sobrenadante se midió con un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices) y las actividades hemolíticas relativas del tampón Tris-HCl y Triton X-100 al 0,1 % se consideraron del 0 % y del 100 %, respectivamente. Los ensayos hemolíticos se realizaron con tres repeticiones y el protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (Junta de Revisión Institucional No. E2211/001–003).

En cada punto de tiempo, todos los datos experimentales se recopilaron por triplicado. Se utilizaron análisis de varianza unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey y pruebas t no pareadas para determinar las diferencias significativas mediante la interpretación de los valores P. La significación estadística se fijó en P < 0,05 y el análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 6.01 (GraphPad Software).

Las defensinas 1 y 2 de los piojos del cuerpo y de la cabeza se alinearon utilizando el CLC Main Workbench 8 (Qiagen, Hilden, Alemania) (Fig. 1). Las secuencias del marco de lectura abierto (ORF) de la defensina 1 del piojo del cuerpo (BLDef1) y la defensina 1 del piojo de la cabeza (HLDef1) coincidieron completamente con la secuencia de referencia BLDef1 (Número de acceso: XP_002428138.1). BLDef1 y HLDef1 eran idénticos y constaban de 109 aminoácidos, incluido un péptido señal de 20 aminoácidos, un propéptido de 46 aminoácidos y una región peptídica madura de 43 aminoácidos. La secuencia ORF de la defensina 2 del piojo del cuerpo (BLDef2) era completamente idéntica a la secuencia de referencia (Número de acceso: XP_002432619.1) pero era ligeramente diferente de la secuencia de la defensina 2 del piojo de la cabeza (HLDef2). En comparación con la secuencia de 116 aminoácidos de HLDef2, BLDef2 estaba compuesta por 113 aminoácidos debido a la eliminación de un residuo de cisteína en la región del péptido señal y dos residuos (lisina y ácido glutámico) en la región del propéptido; además, se encontraron dos sustituciones de aminoácidos entre BLDef2 y HLDef2: una en la región propeptídica (glutamina en la posición de aminoácido 29 para BLDef2 frente a arginina en la posición de aminoácido 30 para HLDef2) y la otra en la región de péptido maduro (tirosina en posición de aminoácido 105 para BLDef2 y ácido aspártico en la posición de aminoácido 108 para HLDef2). La sustitución de aminoácidos radicales de ácido aspártico por tirosina en el péptido maduro de BLDef2 implicaba la posibilidad de diferentes actividades biológicas entre BLDef2 y HLDef2.

Alineaciones de las secuencias de aminoácidos de la defensina 1 y la defensina 2 de los piojos del cuerpo y de la cabeza junto con otros insectos que se alimentan de sangre, incluida la pulga del gato y las especies de hemípteros. La flecha indica el punto de inicio de las regiones peptídicas maduras, los asteriscos indican el sitio de escisión del dipéptido para las proteasas similares a la tripsina, los triángulos abiertos indican diferentes aminoácidos entre BLDef2 y HLDef2, los triángulos rellenos indican los seis residuos de cisteína conservados. Las secuencias de BLDef1 (XP_002428138.1) y BLDef2 (XP_002432619.1) se obtuvieron de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). BL, piojo del cuerpo; Def1, defensina 1; Def2, defensina 2; Cf., Ctenocephalides felis; Cl, Cimex lectularius; HL, piojo de la cabeza; Rp, Rhodnius prolixus

Se encontraron sitios de escisión de dipéptidos conservados (-RR- y -KR- en las defensinas del piojo humano y otros insectos, respectivamente) para las proteasas similares a la tripsina entre las regiones del propéptido y el péptido maduro [17], y seis residuos de cisteína conservados estaban presentes en las regiones peptídicas maduras de todas las defensinas examinadas (Fig. 1). El punto de inicio de las regiones peptídicas maduras en todas las defensinas contenía residuos de alanina y treonina (-AT-), con la excepción de la defensina 1 y 2 de la pulga del gato (-VT-). La región C-terminal de todas las defensinas examinadas mostró una alta conservación de dos residuos básicos, ya sea arginina-arginina (RR) o arginina-lisina (RK). Las similitudes de secuencia de los péptidos maduros en las defensinas 1 y 2 en las especies de insectos examinadas fueron relativamente más altas (51,2–72,1 % y 60,5–66,7 %, respectivamente) en comparación con las secuencias completas (33,3–46 % y 31,9–35,9 %, respectivamente).

Las defensinas 1 y 2 de 33 especies de insectos (2 Phthiraptera, 6 Diptera, 14 Hymenoptera, 5 Hemiptera, 3 Coleoptera, 1 Siphonaptera, 1 Thysanoptera, 1 Orthoptera) se alinearon con las de los piojos del cuerpo, y las defensinas 1 y 2 de 46 especies de insectos (2 Phthiraptera, 5 Diptera, 30 Hymenoptera, 4 Hemiptera, 2 Coleoptera, 2 Lepidoptera, 1 Siphonaptera) se alinearon con los de los piojos (Archivo adicional 3: Figura S1). Las regiones peptídicas maduras de las defensinas de las especies de insectos mostraron mayores similitudes de secuencia que las de las secuencias 5'. En particular, se conservaron seis residuos de cisteína en la mayoría de las regiones peptídicas maduras, lo que demuestra que los seis residuos de cisteína son uno de los motivos estructurales representativos en la mayoría de las defensinas de insectos. En el árbol filogenético, las defensinas 1 y 2 de los piojos del cuerpo y de la cabeza se agruparon con las defensinas 1 y 2 de la pulga del gato, Ctenocephalides felis (Siphonaptera), a pesar de la distancia taxonómica entre los piojos y las pulgas (Fig. 2).

Árbol filogenético de defensinas de especies de insectos. El cuadro de puntos rojos indica el clado de defensas contra piojos. El análisis filogenético se realizó utilizando el método de máxima verosimilitud basado en el modelo de Jones-Taylor-Thornton (JTT) con 1000 repeticiones de arranque. Los porcentajes de valores de arranque se representan en cada nodo del árbol. D, dípteros; yo, Ixodida; S, sifonápteros; P, Phthiraptera; H, hemípteros

BLDef1 y HLDef1 poseían el menor número de aminoácidos cargados positivamente (14), mostrando así un valor de pI relativamente más bajo (6,84) y una carga neta a pH 7 (-0,2). La hidrofobicidad (40,37 %) de BLDef1 y HLDef1 fue mayor que la de BLDef2 y HLDef2 (35,34 %) (Tabla 1). Las propiedades estructurales generales de BLDef2 y HLDef2, como el valor de pI, la carga neta y la hidrofobicidad, fueron idénticas excepto por el número de aminoácidos cargados positivamente (18 y 19, respectivamente). BLDef1 y HLDef1 también exhibieron el número más bajo de aminoácidos con carga positiva (10) entre las defensinas eliminadas con propéptido, pero mostraron el pI más alto (9,61) y la carga neta (6,8). BLDef2 y HLDef2 eliminados con propéptido poseían números idénticos de aminoácidos cargados positivamente (11) e idéntico porcentaje de hidrofobicidad (38,24 %), mientras que el pI (8,46 y 8,29, respectivamente) y la carga neta (6,5 y 5,5, respectivamente) eran diferentes y más bajas que las de BLDef1 y HLDef1 con propéptido eliminado. Las defensinas nativas y las defensinas eliminadas con propéptidos del cuerpo y los piojos de la cabeza exhibieron pesos moleculares similares (12,1–12,9 y 6,9–7,4 kDa, respectivamente).

Un análisis estructural 3D reveló que BLDef1 y HLDef1 consistían en una sola hélice α idéntica (His83–Lys93), mientras que BLDef2 y HLDef2 comprendían una hélice α (Asn87-Ile96) y dos hojas β (β1: Gly104-Cys107 ;β2: Cys112-Arg115) (Fig. 3). El péptido maduro de defensina 2 contenía un aminoácido diferente en el bucle entre las dos láminas β antiparalelas, lo que provocó una ligera distorsión del bucle, como se observó en el examen de la imagen fusionada (Fig. 3); sin embargo, las estructuras generales de BLDef2 y HLDef2 eran casi idénticas.

Estructuras proteicas tridimensionales de la defensina 1 (panel izquierdo) y la defensina 2 (panel derecho) de los piojos del cuerpo (arriba) y los piojos de la cabeza (centro). La imagen inferior es la imagen fusionada. Se muestran las cadenas laterales de diferentes aminoácidos entre la defensina 2 del piojo del cuerpo y la defensina 2 del piojo de la cabeza. N-ter, N-terminal; C-ter, C-terminal

Seis sitios putativos de unión a factores de transcripción, que incluyen el tipo jorobado (Hb), el tipo deformado (Dfd), el tipo saltado (Eve), el tipo sin cola (Tll), el tipo emparejado (Prd) y las madres contra dpp (Mad Los sitios similares a ) se identificaron comúnmente en las supuestas regiones reguladoras (800 pb aguas arriba y 200 pb aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción) de BLDef1 y HLDef1, con un sitio de unión similar a Hb adicional presente en 796–802 pb aguas arriba de HLDef1 (Figura 4). En el caso de la defensina 2, cinco factores de transcripción, incluidos sitios similares a Hb, similares a Dfd, similares a Eve, similares a Mad y similares al factor e2 (E2F), se encontraron comúnmente tanto en BLDef2 como en HLDef1, con un adicional El sitio similar a Hb está presente en 88–94 pb aguas arriba de HLDef2 (Fig. 4).

Posibles motivos de unión al factor de transcripción observados en la supuesta región reguladora (800 pb aguas arriba y 200 pb aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción del gen). Las barras con diferentes colores y patrones representan diferentes motivos potenciales. Los diferentes motivos entre el piojo del cuerpo y de la cabeza se indican con un asterisco. BLDef, Defensina contra piojos del cuerpo; HLDef, defensina del piojo de la cabeza; Dfd, deformado; Eve, incluso saltó; Hb, jorobado; Mad, madres contra dpp; Prd, emparejado; T11, sin cola

Se predijeron seis sitios de unión a miARN putativos en la 3'UTR de la transcripción de BLDef1, mientras que se predijeron tres sitios de unión a miARN putativos en la transcripción de HLDef1 (Tabla 2). En la 3'UTR de las transcripciones de defensina 2, se predijeron cinco sitios de unión a miARN putativos en BLDef2, mientras que se predijeron cuatro sitios de unión a miARN putativos en HLDef2 (Tabla 2).

Los controles positivos, incluidos ampicilina, kanamicina y gentamicina, inhibieron el crecimiento de E. coli y S. aureus; sin embargo, el crecimiento de C. albicans no se inhibió, incluso a las concentraciones más altas de estos antibióticos (200 μM) y BLDef1 y BLDef2 recombinantes (100 μM) (Cuadro 3). La ampicilina inhibió a S. aureus, con valores de concentración inhibitoria media máxima (IC50) 44,5 veces más bajos (P = 0,0007) que los de E. coli, mientras que la kanamicina inhibió a E. coli, con valores de IC50 8,5 veces más bajos (P = 0,002 ) que los de S. aureus, lo que indica que estos dos antibióticos poseen actividades antimicrobianas altamente específicas que dependen de la especie bacteriana. La gentamicina exhibió valores IC50 más bajos contra E. coli y S. aureus que los otros dos antibióticos y las defensinas recombinantes del cuerpo y los piojos de la cabeza. BL/HLdef1 y BLDef2 recombinantes purificados solo inhibieron el crecimiento de S. aureus, con valores IC50 similares (33,2 ± 1,4 μM y 34,4 ± 0,8 μM, respectivamente; P = 0,2669), que fueron aproximadamente 20 y 48 veces menos potentes que ampicilina (P < 0,0001) y gentamicina (P < 0,0001), respectivamente, pero 1,8 veces más potente que la kanamicina (P = 0,0093 y 0,0114, respectivamente). HLDef2 mostró valores IC50 6,1, 6,4 y 11,4 veces más bajos contra S. aureus que BL/HLDef1 (P = 0,004), BLDef2 (P = 0,0031) y kanamicina (P < 0,0001), respectivamente. Estos resultados indican que las defensinas de los piojos poseen una actividad antimicrobiana específica de bacterias Gram-positivas más efectiva que la kanamicina, y que HLDef2 posee una actividad antimicrobiana significativamente mayor contra S. aureus Gram-positiva que BLDef2.

El tratamiento con gentamicina 50 μM como control positivo resultó en una inhibición del 98,4 % del crecimiento de colonias de B. quintana en comparación con el control negativo tratado con tampón Tris-HCl (Fig. 5). HLDef2 recombinante mostró una actividad antibacteriana significativamente mayor contra B. quintana (97,2 %) (P < 0,0001) que BLDef2 (31,5 %) (P = 0,0023). El BL/HLDef1 recombinante no mostró ninguna actividad antibacteriana aparente contra B. quintana.

una imagen representativa de gentamicina (P, control positivo), tampón Tris-HCl (N, control negativo) y mezcla de Bartonella quintana tratada con BL/HLDef1, BLDef2 o HLDef2 colocada en una placa de agar chocolate. Se usaron gentamicina y tampón Tris-HCl como control positivo y negativo, respectivamente. b Resultado del ensayo de inhibición de la mezcla de B. quintana con defensinas de piojo recombinantes. El índice de colonias se obtuvo a partir de unidades formadoras de colonias/microlitro (UFC/μl) dividido por UFC/μl de control negativo bajo el supuesto de que el tampón Tris-HCl no inhibe B. quintana. Los resultados se analizaron estadísticamente utilizando un análisis de varianza unidireccional. Los asteriscos indican diferencias significativas en **P < 0,01 y ***P < 0,0001; ns, ninguna diferencia significativa. BL/HLDef1, Piojo del cuerpo/piojos de la cabeza defensina 1; BLDef2, defensina 2 para piojos del cuerpo; HLDef2, defensina 2 del piojo de la cabeza

Las defensinas de insectos generalmente son activas contra un amplio espectro de patógenos [18]. Aunque el BL/HLDef1 recombinante solo fue activo frente a S. aureus grampositivo, el BL/HLDef2 recombinante mostró una actividad antibacteriana significativamente alta frente a S. aureus grampositivo y B. quintana gramnegativo. Casos similares, en los que la defensina mostró actividad contra bacterias Gram-negativas, se informaron previamente en una variedad de artrópodos [19,20,21,22,23,24]. Sin embargo, las defensinas de los piojos no mostraron ninguna actividad hemolítica aparente a pesar de sus actividades antibacterianas sustancialmente altas, una observación también reportada para otras defensinas [17, 25].

Las defensinas de insectos suelen tener un bucle N-terminal y una hélice α seguida de una estructura de hoja β antiparalela conectada por enlaces disulfuro [26]. BL/HLDef2 mostró estas estructuras únicas; sin embargo, BL/HLDef1 parecía tener solo un fragmento de hélice α y tres pares de cisteínas específicos de defensina sin una lámina β. Además, las defensinas de piojos mostraron altos valores de pI, similares a otras defensinas de insectos que ejercen actividad antibacteriana a través de la interacción entre péptidos con carga positiva y componentes de la membrana bacteriana con carga negativa (es decir, polisacárido y lipopolisacárido en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, respectivamente) [ 27].

Entre los tres dominios de las defensinas (péptido señal, propéptido y péptidos maduros funcionales), generalmente se considera que el propéptido inhibe la actividad antimicrobiana del dominio C-terminal en las α-defensinas de los neutrófilos humanos (HNP) por sus cargas netas opuestas [28] . La activación de las HNP catiónicas requiere la escisión proteolítica del propéptido aniónico [29], lo que indica que las fuerzas electrostáticas pueden ser críticas para las interacciones intermoleculares inhibitorias entre el péptido maduro catiónico y el propéptido aniónico de defensina [29]. Los propéptidos y los péptidos maduros de BL/HLDef1 y BL/HLDef2 también exhibieron cargas netas opuestas: la carga neta del péptido catiónico maduro de BL/HLDef1 fue 7,8 y las de BLDef2 y HLDef2 fueron 7,8 y 6,8, respectivamente. Por el contrario, las cargas netas del propéptido aniónico de BL/HLDef1 fueron -8 y las de BL/HLDef2 fueron -2 y -1, respectivamente. Dado que estos hallazgos indican una posible interacción electrostática inhibitoria entre el propéptido y el péptido maduro de las defensinas de los piojos, expresamos solo los dominios peptídicos maduros de las defensinas de los piojos sin propéptidos e investigamos sus propiedades biológicas.

El HLDef2 recombinante mostró una actividad antibacteriana significativamente mayor contra B. quintana gramnegativa y S. aureus grampositiva que BL/HLDef1 o BLDef2 recombinante. Dado que solo un residuo de aminoácido (tirosina para BLDef2 frente a ácido aspártico para HLDef2) en la región peptídica madura de la defensina 2 difiere entre los piojos del cuerpo y de la cabeza, esta diferencia de aminoácidos probablemente sea responsable de la actividad antibacteriana diferencial contra B. quintana y S. .áureo. El único factor significativamente diferente causado por la sustitución de aminoácidos en las propiedades estructurales entre BLDef2 y HLDef2 fue la carga neta a pH 7. El aumento de la carga neta (+ 6,5 para BLDef2 frente a + 5,5 para HLDef2) resultó de la sustitución de ácido aspártico por tirosina en BLDef2 y puede contribuir a la reducción de la actividad antibacteriana contra B. quintana Gram-negativa y S. aureus Gram-positiva, como se observa generalmente en las defensinas de insectos, donde una carga neta más baja se asocia con actividades antimicrobianas altas contra bacterias Gram-negativas [ 30]. Además, como lo demuestra la ingeniería de la defensina de Nasonia vitripennis como modelo [31], el subdominio de la hoja β de las defensinas de insectos es un factor importante para la amplia actividad antibacteriana contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Por lo tanto, es probable que la alteración estructural en el subdominio de la hoja β causada por la sustitución con un residuo de tirosina en el giro β afecte la actividad antibacteriana de BLDef2. En conjunto, el aumento de la carga neta y el cambio estructural en el subdominio de la hoja β de BLDef2 parecen ser los principales determinantes de la reducción de la actividad antibacteriana, particularmente contra B. quintana en los piojos del cuerpo, que a su vez probablemente haya aumentado la competencia del vector.

La única diferencia en los sitios de unión del factor de transcripción de la defensina 1 y 2 entre los piojos del cuerpo y de la cabeza fue la presencia de un sitio de unión adicional a la proteína similar a la Hb en las regiones reguladoras de HLDef1 y HLDef2. Hunchback pertenece a la familia de proteínas con dedos de zinc C2H2 que funciona como una proteína reguladora de genes [32]. No está claro si las proteínas similares a Hb activan o reprimen la transcripción de genes de defensina en el cuerpo y los piojos de la cabeza. Sin embargo, asumiendo el papel activador de la transcripción de la proteína similar a Hb en los piojos, la presencia de un sitio de unión adicional para la proteína similar a Hb en HLDef1 o HLDef2 puede resultar en un nivel de transcripción basal más alto en los piojos de la cabeza [4] y en el expresión inducible de defensina 1 en los tejidos del tracto alimentario de los piojos de la cabeza después del desafío oral con B. quintana [5]. Los miARN son una clase de ARN cortos, endógenos y no codificantes con una longitud de 21 a 24 nucleótidos que regulan la expresión génica a través del emparejamiento de bases con los ARNm [33]. La "secuencia semilla" de miARN con dos a ocho nucleótidos en el extremo 5' se une al sitio complementario en la 3'UTR de los ARNm, lo que da como resultado la inhibición de la traducción y expresión del gen objetivo o la degradación del ARNm [34]. Se predijo un mayor número de sitios de unión putativos de miARN (6) en la transcripción 3'UTR de BLDef1 en comparación con la transcripción de HLDef1 (3). Asimismo, se predijo un mayor número de sitios de unión putativos de miARN (5) en la 3'UTR de BLDef2 en comparación con la transcripción de HLDef2 (4). Estos hallazgos sugieren que es más probable que la expresión de BLDef1 y BLDef2 esté regulada a la baja que la de HLDef1 y HLDef2 en el piojo de la cabeza. Por lo tanto, la expresión relativamente reducida de BLDef1 y BLDef2 en los piojos del cuerpo parece contribuir a mejorar la competencia del vector [5].

Comprender el sistema inmunitario de un vector transmisor de enfermedades humanas es de gran importancia porque es el sistema inmunitario el que determina en gran medida la competencia del vector. Sin embargo, la cascada de defensa inmunitaria contra patógenos bacterianos, como B. quintana, R. prowazekii y B. recurrentis, en los piojos del cuerpo aún se desconoce en gran medida. Sin embargo, aclaramos (i) que los piojos del cuerpo tienen una defensina 2 alterada funcionalmente, que es significativamente menos eficaz contra B. quintana, un patógeno modelo utilizado en este estudio, y (ii) que la expresión tanto de la defensina 1 como de la defensina 2 es probablemente regulado a la baja debido a la diferencia en las secuencias reguladoras para la unión del factor de transcripción y la unión de miARN. Por lo tanto, la competencia de vector relativamente más alta de los piojos del cuerpo parece deberse principalmente a la actividad antibacteriana reducida de la defensina 2 contra las bacterias patógenas y las cantidades más bajas de BLDef1 y BLDef2.

La defensina 1 y la defensina 2, los únicos péptidos antimicrobianos en el cuerpo humano y los piojos de la cabeza, exhiben diferencias en estructura y actividad antimicrobiana. Las actividades antibacterianas significativamente más bajas de la defensina 2 junto con la probabilidad reducida de actividades de expresión y transcripción de defensina en los piojos del cuerpo probablemente contribuyen a la respuesta inmunitaria relajada a la proliferación y viabilidad de B. quintana, lo que resulta en una mayor competencia de vector de los piojos del cuerpo en comparación con los piojos de la cabeza. Estos datos facilitarán una comprensión profunda de la competencia vectorial diferencial mediada por las defensinas 1 y 2 entre los piojos del cuerpo y de la cabeza.

No aplica.

péptido antimicrobiano

Defensina del piojo del cuerpo

Unidad de formación de Colonia

Deformado

factor E2

incluso saltado

Jorobado

Defensina del piojo de la cabeza

Concentración inhibitoria media máxima

madres contra dpp

microARN

Solución salina tamponada con fosfato

Emparejado

glóbulo rojo

Rabón

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Nos gustaría agradecer a la Prof. Jane Koehler (Universidad de California, San Francisco) por la cepa B. quintana JK31 y al Prof. Jinki Yeom (Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl) por sus interesantes debates.

Este trabajo fue apoyado en parte por el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl. DEL fue apoyado por el programa Brain Korea 21 Four.

Instituto de Investigación de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, República de Corea

Kyungjae Andrew Yoon y Si Hyeock Lee

Departamento de Biotecnología Agrícola, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, República de Corea

Do Eun Lee y Si Hyeock Lee

Departamento de Medicina Tropical y Parasitología, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 03080, República de Corea

Yoo Hyeon Kim

Instituto de Enfermedades Endémicas, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 03080, República de Corea

Yoo Hyeon Kim

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KAY realizó experimentos y escribió el manuscrito. DEL realizó experimentos. SHL y JHK diseñaron el estudio. JHK supervisó el trabajo de investigación y escribió el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ju Hyeon Kim.

El sistema de crianza in vitro de piojos del cuerpo y de la cabeza usando sangre humana y el ensayo hemolítico de defensinas de piojos del cuerpo y de la cabeza fueron revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Nacional de Seúl, IRB No. E2211/001–003.

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Cebadores utilizados para la expresión in vitro de defensina 1 y 2 de piojos del cuerpo y de la cabeza.

Actividades hemolíticas de defensinas recombinantes de piojos del cuerpo y de la cabeza y antibióticos.

Alineaciones de secuencias de aminoácidos de defensina 1 y 2 de piojos del cuerpo y de la cabeza y otras especies de insectos. Seis residuos de cisteína conservados están marcados con recuadros rojos.

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Reimpresiones y permisos

Yoon, KA, Lee, D., Lee, S. et al. Explorando el papel potencial de las defensinas en la competencia de vectores diferenciales de los piojos del cuerpo y de la cabeza para Bartonella quintana. Vectores de parásitos 16, 183 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05802-4

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Recibido: 21 febrero 2023

Aceptado: 08 mayo 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05802-4

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