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May 31, 2023

Análisis del impacto de las variantes DGAT1 p.M435L y p.K232A en pre

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8999 (2023) Citar este artículo

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DGAT1 está desempeñando un papel importante en el metabolismo de las grasas y la síntesis de triacilglicéridos. Hasta la fecha, solo se han informado dos variantes de pérdida de función de DGAT1 que alteran los rasgos de producción de leche en el ganado, a saber, p.M435L y p.K232A. La variante p.M435L es una alteración rara y se ha asociado con la omisión del exón 16, lo que da como resultado una proteína truncada no funcional, y el haplotipo que contiene p.K232A se ha asociado con modificaciones de la tasa de corte y empalme de varios intrones DGAT1. En particular, la causalidad directa de la variante p.K232A en la disminución de la tasa de corte y empalme de la unión del intrón 7 se validó mediante un ensayo de minigenes en células MAC-T. Como se demostró que estas dos variantes de DGAT1 eran empalmógenas, desarrollamos un ensayo génico completo (FLGA) para volver a analizar las variantes p.M435L y p.K232A en células HEK293T y MAC-T. El análisis cualitativo de RT-PCR de las células transfectadas con el constructo de expresión de DGAT1 de longitud completa que porta la variante p.M435L destacó la omisión completa del exón 16. El mismo análisis realizado con el constructo que porta la variante p.K232A mostró diferencias moderadas en comparación con el modelo salvaje. tipo construcción, lo que sugiere un posible efecto de esta variante en el empalme del intrón 7. Finalmente, los análisis cuantitativos de RT-PCR de células transfectadas con la construcción portadora de p.K232A no mostraron ninguna modificación significativa en la tasa de empalme de los intrones 1, 2 y 7. En conclusión, el DGAT1 FLGA confirmó el impacto de p.M435L previamente observado in vivo, pero invalidó la hipótesis según la cual la variante p.K232A disminuyó considerablemente la tasa de corte y empalme del intrón 7.

El diaglicérido O-aciltransferasa 1 codificado por el gen DGAT1 es la enzima que cataliza la síntesis de triglicéridos a partir de diglicéridos y acil-coenzima A. En 2002, la variante sin sentido DGAT1 p.K232A (BTA14:611019AA>GC) se asoció con variaciones importantes de producción y composición de leche en bovinos1. La frecuencia de esta variante depende de la raza considerada, pero es común encontrarla en las principales razas de vacas lecheras. Debido a su importante resultado económico en la industria láctea, el papel de la variante bovina DGAT1 p.K232A ha sido ampliamente estudiado y revisado2. De manera global, la variante p.K232A se asoció a menor rendimiento de grasa, contenido de grasa y contenido de proteína y mayor rendimiento de proteína y lactosa en la producción de leche. Desde un punto de vista funcional, esta variante demostró disminuir significativamente la actividad de la enzima DGAT1, de manera concordante con la disminución del porcentaje de grasa láctea medido en heterocigotos y homocigotos portadores de p.K232A3. Además de eso, también se detectó el uso de un sitio de empalme 5' críptico (5'SS) dentro del exón 8, más marcadamente en animales que albergan el alelo p.K232. Sin embargo, este mecanismo específico no se identificó como un elemento importante que pudiera explicar los cambios en los fenotipos de la leche, ya que la diferencia en términos de proporción de transcripción anormal/normal entre animales homocigotos para el alelo p.K232, homocigotos para el alelo p.A232 y heterocigotos fue débil3.

Muy recientemente, Fink et al. investigó la spliceogenicidad de la variante p.K232A más profundamente utilizando un enfoque basado en métodos complementarios in vivo e in vitro4. Después de realizar un análisis de asociación utilizando un conjunto de datos de RNA-seq mamario que representaba a 375 vacas lactantes y 3128 variantes de secuencia imputadas previamente que se encuentran en un intervalo de 1 Mbp que se superpone al gen DGAT1, observaron que el haplotipo que contiene p.K232A se asoció in vivo con una expresión disminuida de DGAT1 y modificaciones de la tasa de empalme de varios intrones. Curiosamente, la variante p.K232A fue el principal SNP asociado con respecto a la modificación del empalme de los intrones 2 y 7. Además, un ensayo de minigenes en células epiteliales mamarias bovinas (MAC-T) reveló que esta variante disminuyó la tasa de corte y empalme del intrón 7, lo que significa que p.K232A provoca la modificación del corte y empalme del intrón 7 observado in vivo.

De Fink et al. En el estudio, la alteración de la tasa de empalme del intrón 7 pareció ser el efecto de empalme más convincente atribuido directamente a la variante p.K232A, sobre la base de evidencias tanto in vivo como in vitro. Además, los autores señalaron un posible efecto de esta variante en la modificación de la tasa de empalme del intrón 2, ya que estaba fuertemente asociado con este último in vivo, pero no pudieron validar esta hipótesis porque la construcción del minigen que desarrollaron carecía de DGAT1. intrones 1 y 2. Concluyeron que la alteración de la expresión del transcrito DGAT1 podría contribuir a los efectos fenotípicos asociados con la variante p.K232A.

La variante p.M435L es una rara alteración descubierta por Lehnert et al. hace varios años examinando los registros de lactancia de 2,5 millones de vacas para identificar desviaciones significativas de las medias del contenido de proteína y grasa de la leche5. Filtraron 29 animales con parámetros de leche anormales, incluida una vaca que mostraba un contenido de grasa muy bajo, en la que posteriormente identificaron la variante mencionada anteriormente mediante mapeo genético y análisis de secuenciación. La composición detallada de las muestras de leche recolectadas de vacas portadoras de esta variante también reveló una mejora sustancial en la proporción de grasa de leche saturada/insaturada. En una segunda vez, los autores realizaron RT-PCR cualitativa y cuantitativa utilizando ARN total extraído del hígado de ganado de tipo salvaje (WT) en una mano, o alternativamente de animales que portaban la variante p.M435L en el estado heterocigoto u homocigoto en el otra mano Estos análisis de RT-PCR mostraron que esta variante resultó en una omisión casi completa del exón 16 de DGAT1. La proteína resultante se expresó en Saccharomyces cerevisiae y no pudo transferir ácido oleico de la coenzima A al diacilglicerol. Por el contrario, la proteína WT expresada en las mismas condiciones es capaz de catalizar este paso de reacción necesario para obtener un producto enzimático normal. Esta última observación apoyó el papel causal de p.M435L en la producción del fenotipo de leche anormal informado en este estudio.

Full-length gene assays (FLGA) have been routinely used to analyse numerous splicing variants within the human SPINK1 geneA variant on pre-mRNA splicing. Gut 66, 2195–2196 (2017)." href="#ref-CR6" id="ref-link-section-d226774577e452">6,7,8,9,10 and 5’SS GT>GC or GC>GT variants in 43 different genesGT and GT>GC variants differ markedly in terms of their functionality and pathogenicity. Hum. Mutat. 41, 1358–1364 (2020)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR11" id="ref-link-section-d226774577e459">11,GC variants capable of generating wild-type transcripts. Hum. Mutat. 40, 1856–1873 (2019)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR12" id="ref-link-section-d226774577e462"> 12. Para evaluar la empalmogenicidad de una variante, el ensayo minigen es más fácil de emplear que el FLGA y, por lo tanto, se usa más comúnmente. Aunque la FLGA presenta dos ventajas principales. En primer lugar, el análisis de una variante de corte y empalme transportada por un transcrito de pre-ARNm que ha sido generado por un vector de expresión episomal es más relevante desde el punto de vista biológico cuando se integra toda la secuencia del gen, ya que se sabe que la naturaleza y la longitud del contexto de la secuencia afectan al ARN. estructuras y procesos de empalme13,14,15. A continuación, la FLGA permite la evaluación de cualquier tipo de variantes genéticas en el empalme, incluidas las intrónicas profundas. Por lo tanto, creamos un DGAT1 FLGA bovino para validar el efecto de p.M435L y p.K232A en el empalme en un sistema experimental robusto.

La transcripción de ARNm de DGAT1 de longitud completa del exón 1 al exón 17 se amplificó a partir del ARN total de tres preparaciones diferentes de células MAC-T no transfectadas usando el par de cebadores P1-P2 (Fig. 1A). Se observó mediante electroforesis en gel (Fig. 1B) un único amplicón cuyo tamaño coincide con el del transcrito canónico empalmado (es decir, 1220 pb). Por el contrario, la amplificación de regiones específicas de la transcripción que cubre los exones 7 a 9 y 15 a 17 usando los pares de cebadores P3-P4 y P5-P2, respectivamente, produjo múltiples productos (Fig. 1A, B; Figura 1 complementaria). Estos tienen un tamaño correspondiente al transcrito DGAT1 empalmado, pero también a la forma no empalmada y entre formas parcialmente empalmadas. Por último, el genotipado DGAT1 de las células MAC-T mostró que eran homocigóticas para p.A232 (c.694GC) y p.M435 (c.1303A) (Fig. 1C).

Análisis cualitativo por RT-PCR del patrón de empalme endógeno de DGAT1 en células MAC-T. (A) Ilustración que representa la estructura del gen DGAT1 bovino. Los recuadros y líneas azules representan exones e intrones de DGAT1 bovino, respectivamente. Los pares de cebadores P1-P2, P3-P4 y P5-P2 se indican en rojo. (B) Electroforesis en gel de productos de RT-PCR P1-P2, P3-P4 y P5-P2 obtenidos de tres preparaciones diferentes de células MAC-T. Los productos empalmados (s) y sin empalmar (u) se indican con flechas amarillas y su estructura se muestra a la derecha. (C) Genotipo de células MAC-T en las posiciones p.232 y p.435.

La secuencia genómica completa de DGAT1 bovino que albergaba los alelos p.K232 y p.M435 se insertó con éxito en el vector de expresión pcDNA3.1 (+) para obtener la construcción pcDNA3.1-DGAT1 (WT) (Fig. 2A), que se transfectó tanto en MAC-T como en líneas celulares de riñón embrionario humano (HEK293T). La RT-PCR cualitativa utilizada para amplificar el transcrito de DGAT1 completo generó invariablemente un amplicón de un tamaño correspondiente al transcrito de DGAT1 empalmado completamente esperado en ambas líneas celulares (es decir, 1450 pb) (Fig. 2B). Cabe señalar que este producto se originó exclusivamente a partir de la construcción pcDNA3.1-DGAT1, ya que las partes 5'UTR y 3'UTR de la transcripción dirigida por los cebadores P6 y P7 están relacionadas con el vector pcDNA3.1 (+) y no con el genoma bovino. , en contraste con los cebadores P1 y P2 que coinciden con el exón 1 y el exón 17, respectivamente.

Validación de la DGAT1 FLGA. (A) Ilustración que representa la construcción pcDNA3.1-DGAT1 (WT). Los recuadros y líneas azules representan exones e intrones de DGAT1 bovino, respectivamente. La línea negra representa la columna vertebral pcDNA3.1 (+). El par de cebadores P6-P7 y su región objetivo se indican en rojo. (B) Electroforesis en gel de productos P6-P7 RT-PCR obtenidos de células transfectadas con pcDNA3.1-DGAT1 (WT).

El efecto de la variante p.M435L en la omisión del exón 16 se investigó mediante RT-PCR cualitativa que abarcaba los exones 15 a 17 y se realizó en células transfectadas con construcciones pcDNA3.1-DGAT1 (WT) y (M435L) (Fig. 3A ). Se prefirió el uso de la línea celular HEK293T humana al de la línea celular MAC-T bovina. De hecho, el uso de una línea celular no bovina era la única forma de evitar la amplificación de transcritos de DGAT1 endógenos que habrían sesgado el análisis, porque los cebadores de PCR utilizados para amplificar los transcritos de DGAT1 sintetizarán exclusivamente transcritos generados por construcciones pcDNA3.1-DGAT1 a medida que son específicos para bovinos.

Análisis cualitativo de RT-PCR de células HEK293T transfectadas con construcciones pcDNA3.1-DGAT1 (WT o M435L). (A) Ilustración de construcciones de plásmidos utilizadas para RT-PCR cualitativa. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) y pcDNA3.1-DGAT1 (M435L) llevan alternativamente los alelos p.M435 o p.L435, respectivamente. Los recuadros y líneas azules representan exones e intrones de DGAT1 bovino, respectivamente. La línea negra representa la columna vertebral pcDNA3.1 (+). El par de cebadores P5-P2 y su región objetivo se indican en rojo. (B) Electroforesis en gel de productos P5-P2 RT-PCR obtenidos de células HEK293T transfectadas con pcDNA3.1-DGAT1 (WT o M435L). La estructura de los amplicones 1 a 3 se representa a la derecha. NT, no transfectado; RT (-), RT-PCR realizada sin Superíndice III. (C) Validación de la estructura del amplicón de (B) por secuenciación de Sanger. Solo se muestran los límites exón-intrón y exón-exón.

La RT-PCR produjo múltiples productos (Fig. 3B, C; Fig. 2 complementaria) que se purificaron, se clonaron en el vector pCR4-TOPO TA y se secuenciaron. Se identificaron tres productos de PCR principales correspondientes a transcritos sin empalmar, empalmados o con omisión del exón 16. Se observaron transcripciones omitidas en el exón 16 en el contexto de las construcciones (WT) y (M435L). Por el contrario, el producto correspondiente a la transcripción empalmada correctamente se observó exclusivamente para la construcción (WT).

El efecto cualitativo de la variante p.K232A se investigó siguiendo el mismo enfoque que para la variante p.M435L (Fig. 4A). No se encontraron diferencias en la naturaleza de las transcripciones observadas, sin embargo, uno de los productos parece estar presente en mayor cantidad para la variante p.K232A (Fig. 4B, Fig. 3 complementaria). Corresponde a una forma intermedia, parcialmente empalmada del transcrito, en la que todavía está presente el intrón 7, además de los 3 exones amplificados (Fig. 4C). Una banda muy débil y difusa era apenas visible a un peso molecular de poco más de 100 pb en ambas condiciones (WT) y (K232A). Podría corresponder a la isoforma de empalme alternativa menor de DGAT1 generada por el uso de un sitio de empalme críptico dentro del exón 8 y descrita en estudios previos3,4.

Análisis cualitativo de RT-PCR de células HEK293T transfectadas con construcciones pcDNA3.1-DGAT1 (WT o K232A). (A) Ilustración de construcciones de plásmidos utilizadas para RT-PCR cualitativa. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) y pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) llevan alternativamente los alelos p.K232 o p.A232, respectivamente. Los recuadros y líneas azules representan exones e intrones de DGAT1 bovino, respectivamente. La línea negra representa la columna vertebral pcDNA3.1 (+). El par de cebadores P3-P4 y su región objetivo se indican en rojo. (B) Electroforesis en gel de productos P3-P4 RT-PCR obtenidos de células HEK293T transfectadas con pcDNA3.1-DGAT1 (WT o K232A). La estructura de los amplicones 1 a 3 se representa a la derecha. NT, no transfectado; RT (-), RT-PCR realizada sin Superíndice III. (C) Validación de la estructura del amplicón de (B) por secuenciación de Sanger. Solo se muestran los límites exón-intrón y exón-exón.

En el estudio anterior de Fink et al., se demostró que la variante p.K232A disminuía notablemente el empalme del intrón 7 y también se sospechaba que alteraba el empalme del intrón 2. Por esta razón, diseñamos una RT-PCR cuantitativa para evaluar la relación expresión de transcritos empalmados y no empalmados en las uniones 2 y 7 (Fig. 5A, B). También analizamos el cruce 1 ya que, al igual que el cruce 2, no se incluyó en el estudio de Fink et al. debido a limitaciones técnicas. Se seleccionó la línea celular MAC-T para realizar el experimento, porque la RT-PCR cuantitativa permite cuantificar y eliminar la expresión endógena de DGAT1, en contraste con la RT-PCR cualitativa (Fig. 5A). Las construcciones pcDNA3.1-DGAT1 (WT) y (K232A) se analizaron en paralelo para determinar el porcentaje medio de empalme, la expresión media de transcritos empalmados y la expresión media de transcritos no empalmados para cada unión 1, 2 y 7 (Fig. 5C). Se observaron diferencias entre las uniones para estos tres parámetros independientemente del alelo probado, lo que ilustra que las uniones 1, 2 y 7 presentaron una eficiencia de empalme diferente. Por el contrario, no observamos ninguna diferencia significativa entre las condiciones (WT) y (K232A) para ninguno de estos parámetros al considerar una unión determinada.

Análisis cuantitativos de RT-PCR de células MAC-T transfectadas con construcciones pcDNA3.1-DGAT1 (WT o K232A). (A) Flujo de trabajo experimental de un experimento cuantitativo de RT-PCR. (B) Ilustración de construcciones de plásmidos utilizadas para RT-PCR cuantitativa. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) y pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) llevan alternativamente los alelos p.K232 o p.A232, respectivamente. Los recuadros y líneas azules representan exones e intrones de DGAT1 bovino, respectivamente. La línea negra representa la columna vertebral pcDNA3.1 (+) o pcAT7-Glo1. Los pares de cebadores se indican en rojo cuando se dirigen a los límites exón-exón y en verde cuando se dirigen a los límites exón-intrón. Consulte materiales y métodos y la Tabla 1 para obtener más detalles. (C) Porcentaje promedio de empalme, expresión de transcritos empalmados promedio y expresión de transcritos no empalmados promedio para la unión 1 (J1), la unión 2 (J2) y la unión 7 (J7) calculada a partir de tres experimentos de transfección realizados por triplicado. Barras, SD. La expresión relativa atribuida a la expresión endógena de DGAT1 y la contaminación del ADN se restó de las obtenidas en la condición de prueba RT (+) para calcular la expresión relativa final que se presenta aquí. No se observaron diferencias significativas entre las condiciones (WT) y (K232A) en (A, B y C).

Para diseñar el ensayo más confiable, tomamos en consideración dos sesgos técnicos que pueden haber disminuido la precisión de los experimentos cuantitativos de RT-PCR que son i) la expresión endógena de DGAT1 y ii) la contaminación de muestras de ARN por ADN plasmídico. La contribución relativa media a la expresión relativa medida en la condición de prueba de ambas fuentes de error juntas fue inferior al 5 %, independientemente de la RT-PCR cuantitativa considerada (Fig. 6). Como se explica en la sección de materiales y métodos, la expresión relativa atribuida a la expresión endógena de DGAT1 y la contaminación del ADN se restó de las obtenidas en la condición de prueba RT (+) para obtener la expresión relativa corregida que se presenta en la Fig. 5C.

Contribución relativa media de la expresión endógena de DGAT1 y la contaminación del ADN del plásmido a la expresión relativa medida por RT-PCR cuantitativa en la condición de prueba RT (+) calculada a partir de tres experimentos de transfección independientes realizados por triplicado. Unión empalmada (S), unión no empalmada (U). Barras, SD.

DGAT1 es uno de los genes más estudiados en genética bovina debido a su papel preponderante en los fenotipos lácteos. Aunque, hasta ahora, solo se han descrito dos variantes de pérdida de función de DGAT1 en ganado. Las variantes p.K232A y p.M435L se han asociado con defectos de empalme in vivo4,5. Sin embargo, su empalmegenicidad aún no ha sido validada en un sistema experimental robusto. Hemos desarrollado un FLGA DGAT1 para validar el efecto de estas variantes en el empalme, ya que, hasta donde sabemos, es el sistema más confiable para este tipo de análisis. Como p.M435L resultó en la omisión del exón 16 in vivo, usamos FLGA de forma cualitativa para analizar la secuencia de la transcripción DGAT1 en la región que abarca el exón 15 al exón 17. La transcripción DGAT1 generada a partir de pcDNA3.1-DGAT1 (WT) la construcción llevaba el exón 16 y la introducción de la variación p.M435L en la construcción condujo a la omisión completa de este exón. En el estudio in vivo de Lehnert et al., se detectó una cantidad muy pequeña de transcritos empalmados normalmente en ganado homocigoto para p.M435L, lo que fue un resultado comparable al que hemos obtenido en nuestro sistema5. Esto validó el efecto de la variante p.M435L y apoyó el uso del método FLGA para analizar otras variantes de empalme de DGAT1. Usando FLGA, también observamos la presencia de la transcripción omitida del exón 16 en baja cantidad en la condición (WT), que no se observa in vivo. Esto ilustra que aunque el método FLGA permite el estudio de una variante en el contexto de la secuencia de transcripción completa, pueden persistir diferencias entre los patrones de corte y empalme de la transcripción endógena y la transcripción obtenida usando FLGA. De manera más general, si un sistema FLGA no genera la transcripción esperada o genera transcripciones inesperadas en cantidades demasiado grandes, recomendamos no usarlo.

El análisis cualitativo posterior de la variante p.K232A reveló un patrón de empalme ligeramente diferente para esta variante en comparación con la condición WT. Una forma parcialmente empalmada del transcrito con retención del intrón 7 se observó en mayor cantidad para la variante p.K232A. Esta primera observación estaba de acuerdo con la hipótesis de Fink et al. que la variante p.K232A disminuye la tasa de empalme de la unión 7, sin embargo, no se observó diferencia entre las condiciones WT y p.K232A con respecto al producto normalmente empalmado que contiene los exones 7 a 9. Este último punto estaba en contradicción con los resultados de Fink et al. Por otro lado, hay que tener en cuenta que la RT-PCR cualitativa no permite cuantificar con precisión los productos amplificados, por lo que fue necesario desarrollar una RT-PCR cuantitativa para solucionar este problema, tal como lo realizan Fink et al. .

Thus, we attempted to replicate the most compelling result from the Fink et al. study which was the decrease in the splicing rate of junction 7 caused by the p.K232A variant4. The possible effects on the splicing of introns 1 and 2 were also tested. In a manner comparable to theirs, we have set up quantitative RT-PCR and we have measured DGAT1 spliced and unspliced transcripts relative expression at each junction, as the average percentage of splicing, in MAC-T cells transfected with pcDNA3.1-DGAT1 constructs. We did not observe any significant difference between (WT) and (K232A) conditions on any splicing parameters related to junction 1, 2 or 7. Conversely, the minigene assay developed by Fink et al. showed a 4-fold increase in terms of spliced transcript relative expression for the p.K232 allele by comparison to the p.A232 allele in the context of the junction 7, what resulted in a dramatic rise of intron 7 splicing ratio. Such a strong discordance may seem a little surprising but it can be explained by differences in terms of methodological choices or technical considerations between both studies. First, and as we have mentioned in the introduction, using a truncated or chimeric genomic sequence of a gene to perform episomal splicing reporter assays is less reliable than using the full gene sequence. A minigene harbouring all exons of a gene but lacking several of its introns as used by Fink et al. may generate strong false positives. This kind of bias has been unmasked by Wu et al., who used FLGA to analyse the human SPINK1 c.194G>A variant previously classified as strongly spliceogenic using minigene assayA variant on pre-mRNA splicing. Gut 66, 2195–2196 (2017)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR6" id="ref-link-section-d226774577e945"> 6,16. Revelaron que esta variante en realidad no tenía ningún efecto sobre el empalme. Posteriormente, también se reconoce que los experimentos basados ​​en líneas celulares pueden sufrir una falta de reproducibilidad, especialmente cuando los realizan diferentes experimentadores, en diferentes laboratorios y utilizando diferentes preparaciones celulares17. Esto puede haber contribuido a resultados contradictorios entre nuestro estudio y el de Fink et al.

Concluimos que esta variante no tuvo un impacto sustancial en el empalme de las uniones 1, 2 y 7 de DGAT1 por sí sola. Por lo demás, nuestros resultados son consistentes con el hecho de que las variaciones en términos de expresión y eficiencia de splicing observadas in vivo son muy débiles, del orden de un pequeño porcentaje4. Tales pequeñas variaciones pueden no ser detectadas por RT-PCR cuantitativa. Creemos que la variante p.K232A probablemente tiene un pequeño efecto sobre el empalme por sí misma, lo que está respaldado tanto por el hecho de que se encuentra en un potenciador de empalme exónico4 como por el hecho de que observamos un posible efecto mediante el análisis cualitativo de RT-PCR, pero que sigue siendo relativamente anecdótico en comparación con su efecto sobre la función de la proteína. Como se sugirió anteriormente, el efecto muy fuerte de esta variante en el empalme de la unión 7, según lo observado por Fink et al. en su sistema minigene fue probablemente un artefacto relacionado con elecciones metodológicas no óptimas.

La última pregunta abordada en nuestro trabajo se refería a la relevancia de verificar el impacto de ciertos sesgos técnicos cuando se utilizan ensayos de minigenes o FLGA. Según el diseño de la RT-PCR, la cuantificación específica del ARNm producido por un plásmido de expresión puede ser un problema debido a i) la confusión entre la expresión endógena y episomal del gen diana y ii) la contaminación del ARN total por el ADN del plásmido18. La interferencia entre expresiones endógenas y episomales se puede evitar de dos formas. En primer lugar, mediante el uso de cebadores específicos de especie para amplificar exclusivamente el objetivo de la construcción del plásmido, en combinación con una línea celular de una especie diferente pero genéticamente estrechamente relacionada, como hicimos con p.M435L. Alternativamente, utilizando una línea celular en la que el gen diana no se expresa en absoluto. El empleo de una línea celular que se origina en un tejido o una especie diferente a la del gen objetivo no es realmente un problema, ya que el código de corte y empalme está muy conservado entre especies estrechamente relacionadas19, así como las líneas celulares aisladas de diferentes órganos mostraron la mayor parte de el tiempo de resultados comparables cuando se utiliza para realizar ensayos de reportero de empalme20. Por ejemplo, las células HEK293T se han utilizado con éxito para analizar cientos de variantes en decenas de genes expresados ​​en muchos tejidos diferentes mediante ensayos de minigenes y midigenes o FLGA (para ver ejemplos, consulte las referencias citadas en la introducción o 21,22,23). Además, demostramos que la contaminación por plásmidos se puede reducir a un nivel aceptable mediante el tratamiento con ADNasa. Otra opción para evitar cualquier amplificación del ADN plásmido contaminante es diseñar cebadores de RT-PCR solo en exones separados por intrones lo suficientemente largos, pero esto no siempre es posible24. En las condiciones experimentales que utilizamos para realizar una RT-PCR cuantitativa en células MAC-T, la expresión endógena y la contaminación del plásmido en conjunto representaron menos del 5 % de la expresión relativa de DGAT1 en promedio. Dicha contaminación puede considerarse baja y no representa una fuente importante de error. Podríamos haberlo ignorado al calcular la expresión relativa DGAT1 sin que cambiara significativamente los resultados. No obstante, creemos que todo el mundo debería ser consciente de esto antes de iniciar un ensayo de minigenes o FLGA, y cuantificar este nivel de contaminación si es probable que el diseño de RT-PCR permita la amplificación de transcritos endógenos o plásmidos contaminantes. De hecho, si estas contaminaciones son altas, pueden alterar la confiabilidad de los resultados. Finalmente, es importante especificar que la contaminación de plásmidos es un problema que también debe ser considerado al realizar RT-PCR cualitativa. Para dichas RT-PCR no es posible cuantificar la contaminación y sustraerla de la señal de interés, como hemos hecho para las RT-PCR cuantitativas. Por lo tanto, es necesario hacer un esfuerzo adicional para eliminar todos los rastros de contaminación de ADN plasmídico en los ARN, por ejemplo, realizando un paso adicional de tratamiento con ADNasa.

Como comentarios finales, alentamos el uso del método FLGA para analizar variantes de empalme génico, ya que es el ensayo informador de empalme episomal más sólido, especialmente para analizar variantes de empalme hipomórfico o variantes que involucran mecanismos complejos. Por supuesto, el ensayo de minigenes sigue siendo una herramienta útil que encaja bien en muchas situaciones en combinación con datos funcionales, genéticos y fenotípicos complementarios.

Se amplificó un fragmento de 8218 pb que contenía la secuencia genómica DGAT1 desde el final del primer exón hasta el comienzo del último exón (chr14: 604,331-612,548) a partir de una muestra de ADN genómico bovino. Se obtuvo de una vaca Holstein portadora de la variante DGAT1 p.K232A en estado heterocigótico, a la que previamente se le secuenció el genoma completo25. La PCR de largo alcance se realizó con 100 ng de ADN en una mezcla de reacción de 50 µL preparada en hielo que contenía 25 µL 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche) y 0,3 µM de cada cebador C1 y C2 (Tabla 1). El programa de PCR contó con una desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, 32 ciclos de desnaturalización a 98 °C por 20 s, hibridación a 70 °C por 15 s, extensión a 72 °C por 8 min 30 s y una final paso de extensión a 72 °C durante 1 min. Los amplicones se purificaron con el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen). El plásmido de expresión pcDNA3.1 (+) fue doblemente digerido con BamHI y XhoI antes de la inserción de los amplicones previamente generados mediante el kit de clonación In Fusion HD (Takara), según las instrucciones del fabricante. Se analizaron varias construcciones resultantes de este proceso mediante secuenciación de Sanger para verificar la secuencia en las posiciones p.232 y p.435. Se seleccionó un plásmido que portaba los alelos p.K232 y p.M435 para que fuera la construcción pcDNA3.1-DGAT1 (WT), y posteriormente se produjo con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) o el NucleoBond Xtra Midi EF (Masherey Nagel) y se cuantificó usando un NanoDrop™ One (Thermo Scientific). Finalmente, el constructo se validó mediante digestión doble con BamHI y XhoI y la secuencia del gen DGAT1 insertado en el constructo, así como la del ADN genómico utilizado para la clonación, se verificaron completamente mediante secuenciación de Sanger. Se introdujeron dos mutaciones no deseadas en la construcción durante el paso de amplificación por PCR (es decir, BTA14:607550C>T, BTA14:608021C>T), pero estaban ubicadas fuera de los sitios de empalme y lejos de las dos variantes estudiadas.

Las variantes DGAT1 p.M435L (c.1303A>C) y p.K232A (c.694AA>GC) se introdujeron en la construcción pcDNA3.1-DGAT1 (WT) por medio del kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL (Agilent tecnologías). La mutagénesis se realizó en una mezcla de 51 μl que contenía 2,5 U PfuUltra HF ADN polimerasa, 1 μl de mezcla dNTP, 5 μl de tampón de reacción 10x, 3 μl de QuikSolution, 20 ng de pcDNA3.1-DGAT1 y 125 ng de cada cebador de mutagénesis M1 y M2 o alternativamente M3 y M4 (Tabla 1). El programa PCR tuvo una desnaturalización inicial a 95 °C por 1 min, seguida de 18 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 50 s, recocido a 60 °C por 50 s, y extensión a 68 °C por 28 min, y un extensión final a 68 °C durante 7 min. La mezcla de reacción posterior a la PCR se trató con DpnI a 37 °C durante 1 hora, luego 4 µL de los productos resultantes se transformaron en células XL10-Gold Ultracompetent (Agilent Technologies). Las células transformadas se esparcieron en placas de agar LB con 50 μg/ml de ampicilina y luego se usaron varias colonias seleccionadas para preparar producciones de plásmido miniprep con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Los plásmidos Miniprep se analizaron mediante secuenciación de Sanger para verificar la introducción exitosa de la sustitución deseada y se realizó y cuantificó una producción de plásmido NucleoBond Xtra Midi EF a gran escala para cada variante. Las construcciones que albergaban las variantes p.M435L y p.K232A se denominaron pcDNA3.1-DGAT1 (M435L) y pcDNA3.1-DGAT1 (K232A), respectivamente.

Las células HEK293T se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) con suero de ternero fetal al 10% (Sigma Aldrich). Las células MAC-T se cultivaron en DMEM con suero de ternera fetal al 10 % suplementado con L-glutamina 4 mM, penicilina/estreptomicina al 1 %, hidrocortisona 1 µg/l e insulina 50 mg/l. Veinticuatro horas antes de la transfección, se sembraron 3 × 105 células por pocillo en placas de seis pocillos. Para el análisis cualitativo de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT‐PCR), se utilizó 1 μg de plásmidos pcDNA3.1-DGAT1 (WT o M435L) extraídos con el kit QIAprep Spin Miniprep, mezclado con 3 μl del reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) para transfección por pocillo. Para los análisis cuantitativos de RT‐PCR en tiempo real, se mezcló pcDNA3.1-DGAT1 (WT o K232A) con pcAT7-Glo1 en una proporción equimolar para alcanzar una cantidad total de 1 µg, luego se mezcló con 3 µL de reactivo de transfección Lipofectamine 2000. Todos los plásmidos utilizados para la RT-PCR cuantitativa se extrajeron con NucleoBond Xtra Midi EF. El vector pcAT7-Glo1 utilizado en este estudio fue proporcionado por Scott I. Adamson y Brenton R. Graveley en la Universidad de Connecticut, y fue la versión modificada del plásmido en el que se eliminó un sitio aceptor de corte y empalme en el medio del intrón 120 . Para la condición de control de fondo, pcDNA3.1-DGAT1 se reemplazó por pcDNA3.1 (+) plásmido vacío usando las mismas cantidades molares. Cabe destacar que se añadió el plásmido básico pGL3 (Promega) a la mezcla para mantener constante la cantidad final de 1 µg, ya que pcDNA3.1 (+) tenía un peso molecular más bajo que pcDNA3.1-DGAT1. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se extrajo el ARN total utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) mediante la adición de un tratamiento con DNasa en la columna. Los ARN previstos para RT-PCR cualitativa sujetos a interferencia con contaminación de plásmidos (es decir, RT-PCR P5-P2 y P3-P4 realizados en el contexto de FLGA; consulte a continuación una descripción del diseño de RT-PCR) se sometieron a una limpieza de ARN adicional paso usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen). La RT se realizó con el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript III para RT-PCR (Invitrogen) con 1 µg de ARN, 2,5 µM de Oligo(dT) 20, 500 µM de cada dNTP, 5 mM de MgCl2, 5 mM de ditiotreitol, 40 U de RNasaOUT y 200 U Superíndice III siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, solo se usaron 100 ng de ARN para la RT-PCR cualitativa P5-P2 y P3-P4 realizada en el contexto de FLGA. El ADN complementario (ADNc) se degradó con 2 U de RNaseH (Invitrogen). Para cada muestra de ARN, se realizó un control negativo sin la enzima SuperScript III para evaluar la contaminación del ADN en las muestras de ARN total.

Básicamente, la RT-PCR cualitativa se realizó en una mezcla de reacción de 50 µL que contenía 1,25 µL de ADN polimerasa GoTaq® (Promega), MgCl2 1,5 mM, dNTP 200 µM, pares de cebadores "P" 0,5 µM como se describe en la Tabla 1 y 2 µL de ADNc. Tenga en cuenta que se usaron 5 µl de cDNA para la RT-PCR cualitativa P5-P2 y P3-P4 realizada en el contexto de FLGA. Se usaron los pares de cebadores P1-P2, P3-P4, P5-P2 y P6-P7 para amplificar las regiones que abarcan los exones 1 a 17, los exones 7 a 9, los exones 15 a 17 y pcDNA3.1 5'UTR a 3'UTR, respectivamente . El programa de PCR tuvo una desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 30 s, recocido a 58 °C por 30 s, extensión a 72 °C por 1 min 30 s, con un paso final de extensión a 72 °C durante 5 min. Los principales productos de PCR se purificaron en gel y se clonaron en el vector pCR4-TOPO TA (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia de los clones correspondientes a cada transcrito a identificar se comprobó luego mediante secuenciación de Sanger utilizando los cebadores universales M13 directo e inverso.

El ARN total extraído de las células MAC-T cotransfectadas con pcDNA3.1-DGAT1 y pcAT7-Glo1 se analizó mediante RT-PCR cuantitativa. Se usó pcAT7-Glo1 como gen de referencia para calcular la expresión relativa de uniones empalmadas o no empalmadas de transcritos que se originan en pcDNA3.1-DGAT1, de acuerdo con el modelo de cálculo con corrección de eficiencia de Pfaffl26. Como se describe en la Fig. 5B y en la Tabla 1, la expresión de los transcritos empalmados de DGAT1 se cuantificó utilizando pares de cebadores que abarcan dos exones consecutivos, que son Q1 en el exón 1 y Q2 en el exón 2 para la unión 1, Q4 en el exón 2 y Q5 en el exón 3 para unión 2, además de Q7 en el exón 7 y Q8 en el exón 7/8 para la unión 7. La expresión de transcritos no empalmados de DGAT1 se cuantificó utilizando pares de cebadores que abarcan un exón y el siguiente intrón, es decir, Q1 en el exón 1 y Q3 en el intrón 1 para unión 1, Q4 en el exón 2 y Q6 en el intrón 2 para la unión 2, además de Q7 en el exón 7 y Q9 en el intrón 7 para la unión 7. Para evitar sesgos experimentales, la expresión endógena de MAC-T DGAT1 de las células transfectadas con pcDNA3 vacío .1 (+) se midió en paralelo en cada experimento de transfección y se restó de los de pcDNA3.1-DGAT1 para eliminar la señal de fondo (Fig. 5A). Además, se usó el control negativo RT-PCR RT (-) para evaluar la supuesta contaminación del ADN del plásmido en cada muestra de ARN utilizada en la condición de prueba, y para poder restarla de la expresión relativa de DGAT1 medida en el experimento RT (+). de la condición de prueba. Se obtuvo realizando la DGAT1 RT-PCR sin la enzima Superscript III. Después de realizar las PCR de DGAT1 en muestras RT (-), el cálculo de la expresión relativa de DGAT1 generada por la contaminación del plásmido en cada muestra de ARN se realizó expresando la señal de DGAT1 del experimento RT (-) en relación con la señal de referencia del RT correspondiente ( +) experimentar. Luego, la expresión relativa de DGAT1 resultante que representa la contaminación del ADN del plásmido se sustrajo de la RT-PCR de DGAT1 que evalúa la expresión relativa de transcritos empalmados y no empalmados en condiciones de prueba RT (+) para obtener la expresión relativa de DGAT1 corregida que se presenta en la Fig. 5C. Finalmente, el porcentaje medio de empalme observado en una unión determinada se obtuvo dividiendo la expresión media de los transcritos empalmados por la expresión media total de los transcritos. Se analizaron tres experimentos de transfección independientes por triplicado para cada condición, y se evaluó la significación de la diferencia observada entre pcDNA3.1-DGAT1 (WT) y (K232A) en cada tipo de análisis mediante la prueba t de Student con umbral p < 0,05.

Técnicamente, la RT-PCR cuantitativa se realizó por triplicado en un QuantStudio 12k Flex (Applied Biosystems). La mezcla de reacción contenía 10 µL de SYBR™ Master Mix PCR Power SYBR™ Green (Applied Biosystems), pares de cebadores "Q" 0,6 µM como se describe en la Tabla 1 y la Fig. 5B, y 5 µL de ADNc diluido 40 veces en un volumen total de 20 µL. El programa de PCR tuvo un primer paso a 50 °C por 2 min y un segundo paso a 95 °C por 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 15 s, y recocido y extensión a 60 °C por 1 mín. Posteriormente se siguió con un programa de curva de fusión consistente en 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min y 95 °C por 15 s.

Se usó un sedimento que contenía 1,5 millones de células MAC-T para realizar la extracción de ADN usando el kit de células y tejidos Puregene (Qiagen). Las regiones genómicas que abarcan los exones 7 a 9 y 15 a 17 de DGAT1 se amplificaron mediante PCR a partir de este ADN utilizando los pares de cebadores P3-P4 y P5-P2, respectivamente, en las mismas condiciones que se describen anteriormente en "RT-PCR cualitativa". Los amplicones resultantes se analizaron mediante secuenciación de Sanger utilizando los mismos cebadores para determinar el genotipo MAC-T en las posiciones p.232 y p.435 del gen DGAT1.

Los autores confirman que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo.

Grisart, B. et al. Clonación de candidatos posicionales de un QTL en ganado lechero: Identificación de una mutación de sentido erróneo en el gen DGAT1 bovino con un efecto importante en la producción y composición de la leche. Genoma Res. 12, 222–231 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Khan, MZ et al. Asociación de DGAT1 con rasgos de producción de carne y leche de bovinos, búfalos, caprinos y ovinos. Frente. Veterinario. ciencia 8, 712470 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Grisart, B. et al. Confirmación genética y funcional de la causalidad del nucleótido de rasgo cuantitativo DGAT1 K232A que afecta el rendimiento y la composición de la leche. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 101, 2398–2403 (2004).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fink, T. et al. Un nuevo mecanismo para una mutación familiar: la DGAT1 K232A bovina modula la expresión génica a través de la mejora del empalme de exones de múltiples uniones. BMC Genomics 21, 591 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lehnert, K. et al. El cribado de la población fenotípica identifica una nueva mutación en la DGAT1 bovina responsable de la grasa láctea insaturada. ciencia Rep. 5, 8484 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, H. et al. Evidencia in vitro e in silico contra un efecto significativo de la variante SPINK1 c.194G>A en el corte y empalme de pre-ARNm. Tripa 66, 2195–2196 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wu, H. et al. Análisis del impacto de las variantes missense conocidas de SPINK1 en el empalme de pre-mRNA y/o la estabilidad del mRNA en un ensayo de gen de longitud completa. Genes 8, E263 (2017).

Artículo Google Académico

Zou, W.-B. et al. Priorización in silico y caracterización funcional adicional de las variantes intrónicas de SPINK1. Tararear. Genómica 11, 7 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zou, W.-B. et al. Profundizando en las secuencias intrónicas del gen SPINK1. Tripa 65, 1055-1056 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zou, W.-B. et al. Aclaración de la relevancia clínica de las variantes intrónicas de SPINK1 en la pancreatitis crónica. Tripa 65, 884–886 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lin, J.-H. et al. Las variantes GC>GT y GT>GC del sitio de empalme 5' difieren notablemente en términos de su funcionalidad y patogenicidad. Tararear. Mutat. 41, 1358–1364 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Lin, J.-H. et al. Primera estimación de la escala de variantes GT>GC canónicas del sitio de empalme 5' capaces de generar transcritos de tipo salvaje. Tararear. Mutat. 40, 1856–1873 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fu, X.-D. & Ares, M. Control dependiente del contexto del empalme alternativo por proteínas de unión a ARN. Nat. Rev. Genet. 15, 689–701 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalmykova, S. et al. Los emparejamientos de bases de largo alcance conservados están asociados con el procesamiento previo al ARNm de genes humanos. Nat. común 12, 2300 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baralle, FE, Singh, RN & Stamm, S. Estructura del ARN y regulación del empalme. bioquimica Biografía. Acta Gen Regul. mecánico 1862, 194448 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beer, S. & Sahin-Tóth, M. Las variantes exónicas que afectan el empalme del pre-ARNm aumentan la carga genética en la pancreatitis crónica. Tripa 63, 860–861 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Haibe-Kains, B. et al. Inconsistencia en grandes estudios farmacogenómicos. Naturaleza 504, 389–393 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ahlemeyer, B., Colasante, C. y Baumgart-Vogt, E. Análisis del nivel de ARNm derivado de plásmido en presencia de ADN de plásmido residual mediante RT-PCR cuantitativa en dos pasos. Métodos Protoc. 3, 40 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abril, JF, Castelo, R. & Guigó, R. Comparación de sitios de empalme en mamíferos y pollo. Genoma Res. 15, 111–119 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adamson, SI, Zhan, L. & Graveley, BR Vex-seq: Identificación de alto rendimiento del impacto de la variación genética en la eficiencia de empalme de pre-ARNm. Genoma Biol. 19, 71 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Reurink, J. et al. Los ensayos de empalme basados ​​en minigenes revelan el efecto de las variantes de sitios de empalme no canónicos en USH2A. En t. J. Mol. ciencia 23, 13343 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sangermano, R. et al. Los midigenes ABCA4 revelan el espectro de empalme completo de todas las variantes de sitios de empalme no canónicos informadas en la enfermedad de Stargardt. Genoma Res. 28, 100–110 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vázquez-Domínguez, I. et al. Identificación de un alelo complejo en IMPG2 como causa de distrofia macular viteliforme de inicio en adultos. Invertir. Oftalmol. Vis. ciencia 63, 27 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sun, Y., Li, Y., Luo, D. & Liao, DJ Pseudogenes como debilidades de ACTB (Actb) y GAPDH (Gapdh) utilizados como genes de referencia en la transcripción inversa y reacciones en cadena de la polimerasa. PloS One 7, e41659 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boussaha, M. et al. Construcción de una gran colección de pequeñas variaciones del genoma en razas de ganado lechero y de carne francesas utilizando secuencias de genoma completo. Gineta. sel. Evol. GSE 48, 87 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Pfaffl, MW Un nuevo modelo matemático para la cuantificación relativa en RT-PCR en tiempo real. Ácidos Nucleicos Res. 29, e45 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

El vector pcAT7-Glo1 fue un amable obsequio de Scott I. Adamson y Brenton R. Graveley de la Universidad de Connecticut. La línea celular HEK293T fue un amable regalo de Sophie Dhorne-Pollet en la unidad GABI del INRAE.

Universidad París-Saclay, INRAE, AgroParisTech, GABI, 78350, Jouy-en-Josas, Francia

Nicolás Gaiani, Lorraine Bourgeois-Brunel, Dominique Rocha y Arnaud Boulling

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NG y AB: concibieron y diseñaron este estudio. NG y LBB: realizaron los experimentos. NG, DR y AB: analizaron los datos. AB: redacción—preparación del borrador original. NG, DR y AB: redacción—revisión y edición. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Arnaud Boulling.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gaiani, N., Bourgeois-Brunel, L., Rocha, D. et al. Análisis del impacto de las variantes DGAT1 p.M435L y p.K232A en el empalme de pre-ARNm en un ensayo de gen de longitud completa. Informe científico 13, 8999 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36142-z

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Recibido: 11 enero 2023

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 02 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36142-z

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