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May 07, 2023

Caracterización preclínica y anti

Transducción de señales y terapia dirigida

Signal Transduction and Targeted Therapy volumen 8, Número de artículo: 27 (2023) Citar este artículo

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Estimado editor,

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), el agente causante de la enfermedad por coronavirus pandémica mundial 2019 (COVID-19), ha demostrado ser un patógeno respiratorio altamente virulento con una capacidad evolutiva impredecible, lo que representa una amenaza persistente a la humanidad En el momento de la publicación de este manuscrito, la variante dominante de Omicron se caracteriza por una infectividad significativamente mayor, y las subvariantes emergentes muestran sustancialmente el escape de la neutralización inducida tanto por la vacunación como por la infección previa, lo que aumenta el riesgo de avance de la vacuna o reinfección.1 Por lo tanto, la administración oral directa- Se necesitan desesperadamente fármacos antivirales que actúen como contramedidas para reducir la transmisión viral y el riesgo de progresión de la enfermedad a enfermedad crítica o muerte.

Remdesivir (RDV) es el primer análogo de nucleótido aprobado para tratar el COVID-19. La administración temprana de RDV a pacientes de alto riesgo no hospitalizados podría reducir el riesgo de hospitalización o muerte en un 87 %.2 Sin embargo, como fármaco intravenoso obligatorio, el RDV no es de fácil acceso para los pacientes ambulatorios con COVID-19. Anteriormente, descubrimos que el nucleósido C original 1′-CN-4-aza-7,9-dideazaadenosina C (GS-441524) era más potente que el RDV contra el SARS-CoV-2 in vitro.3 Como un esfuerzo continuo para mejorar farmacabilidad y biodisponibilidad oral de GS-441524,4 aquí informamos la caracterización preclínica y la eficacia anti-SARS-CoV-2 de un posible candidato a fármaco nucleósido oral, ATV014.

Inicialmente, diseñamos y sintetizamos una serie de derivados de adenosina basados ​​en la estrategia de profármacos mediante la introducción selectiva de ésteres en el grupo 5′-OH de GS-441524 para obtener 4a ~ 4 m (Fig. S1 complementaria). Entre estos compuestos recién sintetizados, el análogo de carboxilato de ciclohexilo 4a (ATV014) (Fig. 1a, EC50 = 0,48 μM) se identificó como un agente potente contra el replicón del SARS-CoV-2, que era aproximadamente 3,4 veces más potente que el de GS -441524 (EC50 = 1,644 μM) (Tabla complementaria S1). ATV014, el análogo de tetrahidro-2H-piran-4-carboxilato (4 h) y el análogo de palmitato (4 l) se eligieron para comparar el perfil PK en ratas SD (Tabla complementaria S2). Con una dosis oral única de 25 mg/kg, ATV014 demostró una mejora en la biodisponibilidad oral (F%) del 53,4% y T½ de 1,9 h, superior a la de 4 h y 4 l. Teniendo en cuenta la farmacocinética oral y la potencia favorables, se seleccionó ATV014 para más experimentos contra el SARS-CoV-2 con virus vivos. Como se muestra en la Fig. 1b, en células Vero E6, las actividades antivirales de ATV014 contra B.1 (IC50 = 0,46 μM), Beta (IC50 = 0,13 μM), Delta (IC50 = 0,24 μM) y Omicron (IC50 = 0,013 μM) ) mejoraron significativamente en comparación con RDV y GS-441524. Los valores de concentración citotóxica promedio (CC50) de ATV014 en células Vero E6 fueron 263,8 μM. En particular, el índice terapéutico (CC50/EC50) de ATV014 contra la variante de Omicron alcanzó 20292. Además, contra la cepa B.1 en células A549-ACE2, ATV014 mostró un valor de EC50 de 0,0562 ± 0,016 µM (Figura complementaria S2). Estos resultados demostraron la alta potencia, especialmente contra el reciente Omicron prevalente, y la toxicidad relativamente baja de ATV014.

Definición de un potencial fármaco anti-SARS-CoV-2 oral ATV014 y su caracterización preclínica. a Las estructuras químicas de remdesivir, GS-441524 y ATV014. b Actividad antiviral de RDV, GS-441524 y ATV014 contra las cepas B.1, Beta, Delta y Omicron de SARS-CoV-2 y la citotoxicidad correspondiente en células Vero E6. c Esquema de la eficacia profiláctica en un modelo de ratones K18-hACE2. Los ratones K18-hACE2 se inocularon por vía intranasal con la variante Delta del SARS-CoV-2 (5 × 102 PFU de virus por ratón) y se trataron inmediatamente por vía oral con vehículo, ATV014 (100, 300 mg/kg) o EIDD-2801 (300 mg/kg). ), antes de la inoculación y continuada durante tres días (bis in die (BID), n = 4 por grupo). Los siguientes resultados demostraron la abundancia de copias del gen SARS-CoV-2 N en pulmones de ratón a través de qRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real) y la viabilidad del virus a través de FFA (ensayo de formación de foco) a 3 ppp. El límite de detección de qRT-PCR fue de 0,5 copias/μL. La línea discontinua roja indica el límite de detección para el FFA. d Diagrama de flujo de la eficacia terapéutica. Los ratones K18-hACE2 se inocularon por vía intranasal con la variante SARS-CoV-2 Delta (5 × 102 PFU por ratón) y se trataron con vehículo, ATV014 (10, 20, 50, 100 o 200 mg/kg) o EIDD-2801 (200 mg/kg) a las dos horas de la infección por SARS-CoV-2 (n = 10 por grupo). Los siguientes resultados mostraron la abundancia de copias del gen SARS-CoV-2 N en pulmones de ratón a través de qRT-PCR y la viabilidad del virus a través de FFA a 3 ppp. e Imágenes H&E representativas de secciones pulmonares de los pulmones de los ratones tratados con vehículo, 100 mg/kg de ATV014 y 200 mg/kg de ATV014. f Concentraciones plasmáticas medias de ATV014 tras la administración intravenosa única (1,0 mg/kg) y oral (5 y 20 mg/kg) de ATV014 en ratones CD1 (n = 3 por grupo). administración intravenosa única (1,0 mg/kg) y oral (20, 40 y 80 mg/kg) de ATV014 en ratas SD (n = 6 por grupo) y administración intravenosa única (1 mg/kg) y oral (5, 15 y 45 mg/kg) administración en perros beagle (n = 6 por grupo). g Distribución tisular del metabolito clave GS-441524 en ratas macho después de una administración oral única de ATV014 a 80 mg/kg. SI: intestino delgado; IL: intestino grueso. Las barras de error indican SEM. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. ∗P ≤ 0,05; ∗∗P ≤ 0,005; ∗∗∗P ≤ 0,0005; ∗∗∗∗P ≤ 0.0001

Posteriormente, evaluamos la eficacia profiláctica y terapéutica in vivo de ATV014 oral en ratones transgénicos K18-hACE2 infectados con la variante Delta (Figs. 1c y 1d) con molnupiravir (EIDD-2801) como compuesto de referencia.5 El tratamiento se inició en ese momento. de infección en el modelo profiláctico. Tres días después de la inoculación (dpi), las copias de ARN del virus en ratones tratados con ATV014 (100 y 300 mg/kg, BID) se redujeron significativamente. Los títulos de virus en ratones tratados con ATV014 medidos por FFA (ensayo de formación de focos) se redujeron casi al límite de detección, lo que indica que los virus infecciosos en los pulmones se eliminaron significativamente. Para determinar la dosis eficaz más baja en el entorno terapéutico, se administró ATV014 2 h después de la infección. 20, 50, 100 y 200 mg/kg de ARN viral reducido en función de la dosis de ATV014 en los pulmones. ATV014 a 200 mg/kg redujo significativamente el ARN viral en aproximadamente dos órdenes de magnitud (1,4 × 103 copias/μl en comparación con 1,7 × 105 copias/μl en el grupo del vehículo), que fue más potente en relación con 200 mg/kg de molnupiravir (5,4 × 103 copias/μl). En el ensayo de formación de focos, 50 mg/kg y dosis más altas de ATV014 redujeron la concentración del virus infeccioso por debajo del límite de detección. El análisis histopatológico reveló que ATV014 protegía el tejido pulmonar de las lesiones inflamatorias intersticiales y el daño causado por la infección por SARS-CoV-2 Delta (Fig. 1e).

El proceso de síntesis a escala kilométrica de ATV014 se ha optimizado para garantizar el suministro para el estudio clínico. ATV014 se obtuvo como un anhidrato de alta cristalinidad y físicamente estable a 40 °C/75 %HR (abierto) y 60 °C (abierto) durante 30 días, mostrando una buena estabilidad química. ATV014 tuvo un valor de log P experimental favorable de 1,99 y un valor de pKa de 3,5. GS-441524 mostró una permeabilidad moderadamente baja con un valor de Papp (A a B) de 3,62 cm/s × 10−6 en ensayos de permeabilidad de células Caco-2. Por el contrario, ATV014 se comportó como un compuesto meso-hipertónico (Papp (A a B) = 8, 69 cm / s × 10-6) y fue un transportador de salida de sustrato débil con una tasa de salida de 2, 5 (Tabla complementaria S3). La mejora de la permeabilidad de absorción pasiva explicó parcialmente la absorción oral mejorada de ATV014. Después de una administración oral única de 20, 40 y 80 mg/kg de ATV014 a ratas SD, la biodisponibilidad (F) fue del 49 %, 43 % y 68 %, respectivamente (Fig. 1f y Tabla complementaria S4). En comparación, la biodisponibilidad oral de GS-441524 después de la administración de RDV fue solo del 14 % en ratas (Tabla complementaria S5). Mientras tanto, la biodisponibilidad oral de GS-441524 después de la administración de ATV014 varió del 66 al 69 % en ratones y del 78 al 105 % en perros beagle (Fig. 1f y Tabla complementaria S6). La Cmax y el AUC aumentaron de forma dependiente de la dosis en las tres especies. En la administración repetida de 7 días de ATV014 oral en ratas (40 mg/kg, BID) y perros (15 mg/kg, BID), los valores de AUClast y Cmax en el día 1 y el día 7 fueron equivalentes, lo que indica que no se acumuló. en el cuerpo cuando se dosifica repetidamente (Tabla complementaria S7 y S8).

El estudio de metabolismo mostró que se detectaron seis metabolitos de ATV014 en muestras de incubación de ratones, cuatro en muestras de incubación de ratas, perros y humanos y tres en muestras de incubación de monos (Tabla complementaria S9 y Fig. S3). El metabolito hidrolizado M3 (GS-441524) fue el principal metabolito en los hepatocitos de las cinco especies, con porcentajes de área máxima de 93,06 %, 90,27 %, 92,45 %, 96,30 % y 95,64 %, respectivamente. Un estudio adicional de distribución de tejidos mostró que el metabolito primario GS-441524 se distribuyó amplia y rápidamente en tejidos de rata (Fig. 1g y Tabla complementaria S10), especialmente en los pulmones para estar por encima de las concentraciones terapéuticas. ATV014, GS-441524 y la forma activa de trifosfato (RTP) demostraron un perfil de selectividad fuera del objetivo favorable en un amplio panel de 87 objetivos de detección. Las tasas de inhibición fueron <50 % a 20 μM contra todos los objetivos examinados, excepto que ATV014 inhibió el 53 % de la actividad del transportador de adenosina (Tabla complementaria S11). Para los estudios de toxicidad de dosis única, la dosis máxima tolerada (DMT) de ATV014 fue de 2000 mg/kg en ratas y perros. Durante 14 días de estudios de toxicidad de dosis repetidas, los niveles sin efectos adversos observados (NOAEL) de ATV014 fueron de 400 mg/kg y 100 mg/kg, y la MTD fue de 800 mg/kg y 300 mg/kg en ratas y perros, respectivamente. . ATV014 y GS-441524 no presentaron mutagenicidad ni clastogenicidad con respecto a los resultados negativos en la prueba de Ames usando Salmonella, E. coli y prueba de micronúcleos en células de médula ósea. Estos estudios de eficacia anti-SARS-CoV-2 y datos preclínicos validaron ATV014 como un potente antiviral oral para tratar COVID-19 con propiedades farmacocinéticas favorables y perfil de seguridad, que se está investigando en ensayos clínicos (Fase 1, NCT05504746; ensayo iniciado por el investigador , ChiCTR2200064093).

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JSGG20200225150431472, JSGG20210901145403012 y KQTD20180411143323605), la Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (Subvención #2020A1515110361), Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (#2021YFC0 865100), Investigación y desarrollo de áreas clave Programa de la provincia de Guangdong (2021B1111110001) y Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención n.° 32041002, n.° 82150206). DG también cuenta con el apoyo del Programa de Talentos de Guangdong Zhujiang (#2016LJ06Y540) y el Programa Nacional de Diez Mil Talentos. Los autores agradecen a Lu Zhang, Ruyan Liao, Yongxia Shi y Jun Dai del Centro de Tecnología del Distrito de Aduanas de Guangzhou por la ayuda en el experimento de eficacia in vivo. También agradecemos a los otros participantes del proyecto, incluidos Guanguan Li, Shuo Li y Xinjun Liu de Medi-X Pingshan, Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur por el apoyo en el estudio preclínico.

Estos autores contribuyeron por igual: Qifan Zhou, Sidi Yang, Liu Cao, Yang Yang, Tiefeng Xu

Laboratorio clave de Shenzhen para el descubrimiento y la síntesis de fármacos de molécula pequeña, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Academia de Estudios Interdisciplinarios Avanzados y Medi-X Pingshan, Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur, Shenzhen, Guangdong, 518000, China

Qifan Zhou, Qishu Chen, Yingjun Li y Xumu Zhang

Centro de Estudios de Infecciones e Inmunidad (CIIS), Facultad de Medicina, Campus de Shenzhen de la Universidad Sun Yat-sen, Shenzhen, Guangdong, 518107, China

Sidi Yang, Liu Cao, Tiefeng Xu y Deyin Guo

Laboratorio de Guangzhou, Bio-Isla, Guangzhou, China

Sidi Yang y Deyin Guo

Laboratorio Clave de Patógenos e Inmunidad de Shenzhen, Centro Nacional de Investigación Clínica de Enfermedades Infecciosas, Disciplina Estatal Clave de Enfermedades Infecciosas, Tercer Hospital Popular de Shenzhen, Segundo Hospital Afiliado a la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur, Shenzhen, China

Yang Yang y Hongzhou Lu

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profármacos nucleósidos sintetizados por QZ y QC; QZ, YL y SY participaron en la interpretación de datos, figuras preparadas y manuscrito; SY realizó experimentos con animales; LC, TX y YY realizaron ensayos de inhibición a nivel celular y de replicón viral; YL analizó los resultados de los estudios de farmacocinética y toxicidad; XZ, DG e YL concibieron y diseñaron el proyecto, iniciaron la colaboración con HL; DG y XZ fueron responsables del proyecto general como supervisores. Todos los autores han leído y aprobado el artículo.

Correspondencia a Yingjun Li, Deyin Guo o Xumu Zhang.

La Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur y la Universidad Sun Yat-sen han presentado solicitudes de patente relacionadas con el trabajo. XZ, DG, LC, Y.Li., TX y QZ figuran como inventores en esta solicitud. XZ y DG son cofundadores de una nueva empresa, Shenzhen AntiV Pharma Co., Ltd. Todos los demás autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Todos los protocolos de estudio con animales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal y todos los procedimientos utilizados en los estudios con animales cumplieron con las pautas y políticas del Comité de Cuidado y Uso de Animales de las respectivas unidades de investigación.

Caracterización preclínica y eficacia anti-SARS-CoV-2 de ATV014: profármaco de ciclohexanocarboxilato oral de 1′-CN-4-aza-7,9-dideazaadenosina C-nucleósido

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhou, Q., Yang, S., Cao, L. et al. Caracterización preclínica y eficacia anti-SARS-CoV-2 de ATV014: un profármaco de ciclohexanocarboxilato oral de 1′-CN-4-aza-7,9-dideazaadenosina C-nucleósido. Sig Transduct Target Ther 8, 27 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01310-0

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Recibido: 11 agosto 2022

Revisado: 08 diciembre 2022

Aceptado: 03 enero 2023

Publicado: 12 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01310-0

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