Aug 06, 2023
H2O2 daña selectivamente el hierro binuclear
Informes científicos volumen 13,
Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7652 (2023) Citar este artículo
295 Accesos
1 Altmetric
Detalles de métricas
NADH: ubiquinona oxidorreductasa, complejo respiratorio I, juega un papel importante en el metabolismo energético celular al acoplar la transferencia de electrones con la translocación de protones. La transferencia de electrones es catalizada por un mononucleótido de flavina y una serie de grupos de hierro-azufre (Fe/S). Como subproducto de la reacción, la flavina reducida genera especies reactivas de oxígeno (ROS). Se sugirió que las ROS generadas por la cadena respiratoria en general podrían dañar los grupos Fe/S del complejo. Aquí, mostramos que el grupo binuclear Fe/S N1b es dañado específicamente por H2O2, sin embargo, solo en altas concentraciones. Pero en las mismas condiciones, la actividad del complejo apenas se ve afectada, ya que N1b puede pasarse por alto fácilmente durante la transferencia de electrones.
NADH convertidor de energía: ubiquinona oxidorreductasa, complejo respiratorio I, juega un papel importante en la bioenergética celular al acoplar la oxidación de NADH y la reducción de ubiquinona (Q) con la translocación de protones a través de la membrana1,2,3,4,5,6. Consiste en un brazo periférico que cataliza la transferencia de electrones y un brazo de membrana responsable de la translocación de protones. Los dos brazos están dispuestos casi perpendiculares entre sí, lo que da como resultado una estructura en forma de L del complejo. El complejo mitocondrial I consta de 45 subunidades, incluidas 14 subunidades centrales que se encuentran en todas las especies que contienen una NADH:Q oxidorreductasa convertidora de energía7,8. La estructura tridimensional de las subunidades centrales del complejo I se conserva desde las bacterias hasta los mamíferos9,10. El complejo bacteriano de Escherichia coli está compuesto por 13 subunidades diferentes que se denominan NuoA a NuoN, dos de ellas fusionadas con la única subunidad NuoCD11. Están codificados por los nuo-genes y suman una masa molecular de aproximadamente 530 kDa12.
El NADH se oxida en la punta del brazo periférico por transferencia de hidruro al mononucleótido de flavina aceptor primario de electrones (FMN)13. Desde aquí, los electrones se transfieren a una distancia de aproximadamente 100 Å a través de una serie de siete grupos de hierro-azufre (Fe/S) hacia la membrana, donde Q se reduce y protona en una cavidad de unión específica formada por subunidades del periférico y el brazo de membrana1,2,3,4,5,6. Se cree que la especie AQ se mueve de un sitio de unión de alta energía a uno de baja energía dentro de la cavidad, lo que provoca cambios electrostáticos y conformacionales que impulsan la translocación de protones en el brazo de la membrana2,14,15,16. El brazo de la membrana contiene cuatro caminos putativos de protones que están conectados entre sí y con la cavidad Q por un eje central de residuos cargados. Se propuso que el movimiento de la especie Q en su cavidad induce la propagación de una onda 'eléctrica' que avanza y retrocede a través del brazo de la membrana desencadenando la translocación de protones16. Alternativamente, se ha sugerido que la unión de la quinona conduce a una transición de un estado 'abierto' a un estado 'cerrado'10. La reducción de quinona da como resultado una redistribución de protones en el brazo de la membrana, lo que a su vez conduce a una liberación de protones al citoplasma exclusivamente en NuoL10.
La oxidación de NADH por el complejo I está asociada con la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) como el superóxido y el peróxido de hidrógeno17,18,19,20 que contribuyen al estrés celular21. Generalmente se acepta que las ROS generadas por el complejo I se originan en el FMN reducido17,18,19,20. Alrededor del 0,1% al 2% del NADH oxidado conduce a la producción de ROS in vitro22,23,24,25. Las ROS no solo contribuyen al daño oxidativo, como la peroxidación de lípidos, la degradación de proteínas y la oxidación del ADN, sino que también representan señales redox esenciales26,27,28,29.
El cofactor FMN productor de ROS se encuentra en las inmediaciones de los grupos de Fe/S del complejo respiratorio I. Es bien sabido que los grupos de Fe/S expuestos a disolventes son propensos al daño oxidativo30,31. Las estructuras del complejo I de diferentes organismos muestran que sus grupos de Fe/S están mayormente protegidos del solvente y, por lo tanto, deben protegerse de la degradación por ROS7,8,9,10,32,33,34,35,36. Sin embargo, se propuso que una mayor producción de ROS por parte del complejo I y la cadena respiratoria en general podría resultar en daño a los grupos de Fe/S del complejo I37. Aquí, usamos el complejo I de E. coli para probar esta propuesta. Al representar una forma mínima estructural del complejo mitocondrial I, el de E. coli carece de las subunidades accesorias adicionales que rodean el núcleo catalítico. Por lo tanto, los grupos Fe/S del complejo I de E. coli podrían ser más susceptibles al daño oxidativo que sus homólogos en el complejo mitocondrial I. Dado que se sabe que el complejo I de E. coli produce ROS principalmente en forma de H2O238,39, ensayaron la influencia del H2O2 en la actividad del complejo I y su composición de grupos de Fe/S. Resultó que se necesitan concentraciones milimolares de H2O2 para inhibir la actividad de la NADH oxidasa. Si bien la actividad de NADH:decil-ubiquinona del complejo aislado permanece sin cambios en presencia de H2O2 1 mM, demostramos directamente usando espectroscopía EPR que el tratamiento con H2O2 1 mM da como resultado una pérdida selectiva del grupo N1b de Fe/S en la subunidad NuoG.
Debido a la actividad de las catalasas y peroxidasas celulares, la concentración de H2O2 en el citoplasma de E. coli se encuentra en el rango nanomolar bajo40,41. Sin embargo, la adición de H2O2 exógena puede aumentar la concentración intracelular provisional al rango micromolar42. Por lo tanto, el efecto de las concentraciones micromolares de H2O2 sobre la oxidación de NADH mediada por el complejo I se midió inicialmente con la proteína en las membranas. Las membranas citoplasmáticas de la cepa BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis se obtuvieron mediante centrifugación diferencial. Debido a la falta de la NADH deshidrogenasa alternativa (ndh) y la interrupción del nuoperón cromosómico, todas las actividades derivadas de NADH de las membranas de esta cepa reflejan exclusivamente actividades del complejo I de tipo salvaje codificado en el plásmido.
La actividad NADH/ferricianuro oxidorreductasa del complejo I es catalizada por el FMN unido a NuoF y no implica la participación de grupos de Fe/S. Además, esta actividad no está acoplada con la translocación de protones. Resultó que las concentraciones micromolares de H2O2 no tenían efecto sobre esta actividad. Solo las concentraciones milimolares ejercieron un efecto significativo sobre la actividad NADH/ferricianuro oxidorreductasa (Fig. 1A). La titulación con hasta 20 mM de H2O2 dio como resultado una inhibición del 55 % de la actividad con una CI50 aparente de 14,4 mM.
Inhibición del complejo I por H2O2. (A) Actividad NADH/ferricianuro oxidorreductasa de membranas de la cepa BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis. El 100 % de actividad corresponde a 1,4 U mg−1. (B) Actividad NADH oxidasa de membranas de la cepa BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis. 100% de actividad corresponde a 0,27 U mg−1. (C) Actividad NADH:decil-ubiquinona oxidorreductasa del complejo I aislado. El 100% de la actividad corresponde a 21,9 U mg−1. Las líneas rojas a través de los puntos de datos se incluyen solo como guía. Cada punto de datos es el promedio de tres réplicas técnicas de dos muestras biológicas. Las barras representan el SEM en cada punto de datos.
Para ensayar el efecto del H2O2 sobre la actividad fisiológica del complejo I, incluida la transferencia de electrones a través de los grupos de Fe/S a Q, se determinó su influencia sobre la actividad de la NADH oxidasa (Fig. 1B). Como ya se observó para la actividad NADH/ferricianuro oxidorreductasa, el H2O2 inhibe la actividad NADH oxidasa solo en el rango milimolar. La titulación con hasta 20 mM de H2O2 dio como resultado una inhibición de la actividad de aproximadamente un 55 % con una IC50 aparente de 13,5 mM. La similitud de ambas curvas de inhibición sugiere un efecto no específico del H2O2 sobre el complejo I de la membrana.
Para determinar si la inhibición es reversible, se centrifugaron tres veces una alícuota de membranas sin tratar y una alícuota tratada con H2O2 20 mM y cada una se resuspendió en tampón A sin H2O2. La actividad NADH/ferricianuro y NADH oxidasa de la muestra tratada fue del 50 ± 5% de la de la no tratada en ambos casos. Esto sugiere que la inhibición por H2O2 es irreversible.
Para investigar específicamente el efecto del H2O2 en el complejo I, se aisló la proteína en presencia del detergente LMNG (ver la Fig. S1 complementaria) y se midió la inhibición de la actividad oxidorreductasa NADH:decil-Q de la preparación por H2O2. En el rango de hasta 1,25 mM de H2O2 no se detectó ningún efecto sobre la actividad del complejo I (Fig. 1C). Una adición de H2O2 20 mM dio como resultado una inhibición de la actividad del 65%. En resumen, nuestros experimentos demuestran que a las concentraciones observadas en condiciones fisiológicas, el H2O2 no tiene efecto sobre la actividad del complejo I.
Para determinar si el H2O2 es capaz de dañar los agregados de Fe/S del complejo, se dividió una preparación en alícuotas y las muestras se trataron con tampón o con un volumen igual de H2O2 en varias concentraciones. Las muestras se redujeron en un exceso molar de 2000 veces de NADH, se incubaron con H2O2 durante un minuto a temperatura ambiente y luego se congelaron en una solución refrigerante a 150 K. Los espectros EPR se registraron a 40 K y 2 mW de potencia de microondas para detectar los dos binucleares. Racimos de Fe/S del complejo I, N1a y N1b. Además, se registraron espectros a 13 K y 5 mW para detectar los grupos tetranucleares N2, N3 y N4. Los otros grupos de Fe/S del complejo no son detectables por EPR43. La muestra suministrada solo con tampón se utilizó como referencia. Las muestras que primero se trataron con H2O2 y luego se redujeron con NADH dieron como resultado espectros EPR similares. La incubación de las muestras con H2O2 durante 30 min antes o después de la reducción por NADH no produjo cambios espectrales.
El espectro de la muestra de referencia obtenido a 40 K y 2 mW de potencia de microondas mostró la presencia de los cúmulos binucleares N1a (gx,y,z = 1,92, 1,94 y 2,00) y N1b (g//,⊥ = 2,03 y 1,94; Figura 2a). Las señales de los grupos tetranucleares de Fe/S N2 (g//,⊥ = 1,91 y 2,05), N3 (gx,y,z = 1,88, 1,92 y 2,04) y N4 (gx,y,z = 1,89, 1,93 , y 2.09) estuvieron presentes en el espectro registrado a 13 K y 5 mW de potencia de microondas además de las señales de los cúmulos binucleares (Fig. 2d).
Espectros EPR del complejo I de E. coli aislado a varias concentraciones de H2O2. Los espectros se registraron a partir de una muestra no tratada (a,d), una alícuota incubada con 100 µM (b,e) y 1 mM (c,f) H2O2. Los espectros se registraron a 40 K y 2 mW de potencia de microondas (fila izquierda, a–c) para detectar los cúmulos binucleares de Fe/S y a 13 K y 5 mW de potencia (fila derecha, d–f) para detectar adicionalmente los tetranucleares Fe/S. racimos S. Las señales individuales se asignan a los distintos grupos de Fe/S de acuerdo con59. La región g central alrededor de g = 1,94 está perturbada en (f) debido a la falta de g⊥ de N1b en 1,94.
Los espectros de EPR de las muestras que se incubaron con hasta 100 µM de H2O2 no mostraron ningún cambio espectral significativo (Fig. 2b, e). Sin embargo, la muestra tratada con H2O2 1 mM mostró claramente una pérdida drástica y específica del grupo N1b (Fig. 2c,f). La diferencia del espectro de la muestra sin tratar obtenida a 40 K menos el de la muestra tratada con H2O2 1 mM muestra claramente las señales del grupo N1b (ver la Fig. S2 complementaria). Por lo tanto, la proporción de N1a no ha cambiado, ya que, de lo contrario, su señal también sería detectable en el espectro de diferencia. Sin embargo, no se puede deducir una oxidación completa de N1b a partir del espectro de diferencia. La pérdida del grupo N1b también se ve en los espectros registrados a 13 K y 5 mW de potencia de microondas (Fig. 2c, f). Aquí, todavía se puede detectar una cantidad residual de N1b en los espectros registrados a 13 K (Fig. 2f), lo que sugiere que el grupo no está completamente dañado. La doble integración de la señal de N1b en g = 2,03 que no tiene superposición con otras señales mostró que el 68 % de N1b se daña con 1 mM de H2O2. Sin embargo, la cantidad del grupo binuclear N1a y de los grupos tetranucleares N2, N3 y N4 no cambió incluso en presencia de H2O2 50 mM. Por lo tanto, H2O2 1 mM conduce a un daño específico del grupo binuclear N1b, mientras que incluso las concentraciones más altas de H2O2 en nuestros ensayos no tienen efecto en los otros grupos de Fe/S del complejo I.
Para distinguir si el grupo N1b está simplemente oxidado o "sobreoxidado" por H2O2, el complejo I se incubó durante 5 min con H2O2 1 mM. Posteriormente, el exceso de H2O2 se eliminó mediante concentración y dilución repetidas. La muestra se redujo con NADH y el espectro EPR muestra la falta del grupo N1b (ver la Fig. S3 complementaria). Por lo tanto, N1b es dañado irreversiblemente por H2O2 y no simplemente oxidado.
La estructura del complejo de varias especies muestra que los centros Fe/S no están expuestos al solvente. No obstante, para descubrir por qué N1b puede ser atacado por H2O2, observamos más de cerca la estructura crio-EM del brazo periférico del complejo E. coli que contiene todos los grupos de Fe/S44. N1b está coordinado por cuatro residuos de cisteína de un pliegue típico de ferredoxina [2Fe–2S] en la parte N-terminal de NuoG (Fig. 3). Este dominio conecta NuoE y NuoF con NuoG. El grupo N1b se localiza a una distancia de aproximadamente 5 Å de la superficie de NuoG pero sin acceso directo al solvente (Fig. 3). Usamos el programa CAVER para identificar posibles canales de solventes que podrían conducir desde la superficie de la proteína al grupo. Un canal con un diámetro de 2,28 Å conduce desde el solvente al grupo (Fig. 3A). El canal está flanqueado por los residuos Gly45G, Arg46G y Met67G (el superíndice se refiere al nombre de la subunidad del complejo I de E. coli). El complejo mitocondrial I contiene varias subunidades accesorias, cuyo número depende del organismo en particular. Sin embargo, ninguna de estas subunidades accesorias protege más al grupo N1b hacia el solvente. De manera ejemplar, el entorno del grupo N1b del complejo I de las mitocondrias ovinas36 se muestra en la Fig. 3B. En el complejo mitocondrial I, N1b se encuentra a unos 8,2 Å por debajo de la superficie de la proteína. Aquí, el canal tiene un diámetro ligeramente menor de 2,26 Å y se extiende sobre una distancia mayor en forma de U (Fig. 3B). Esto se debe a la presencia de Leu225 de la subunidad NDUFV1, el homólogo de E. coli NuoF, y Arg53 de NDUFS1, el homólogo de E. coli NuoG, que bloquean la ruta directa al grupo. En el complejo ovino I, el camino está controlado por los residuos Gly50, Arg53, Ala67 y Ala70 de NDUFS1 y Tyr118 de la subunidad NDUFS4, una subunidad accesoria que es un homólogo estructural de un dominio extra de NuoG44. Los canales de solvente son lo suficientemente grandes en ambos organismos para permitir el paso de H2O2 al grupo. Algunos de los átomos del revestimiento son hidrofóbicos y dificultan el paso rápido, pero sin bloquearlo. Por lo tanto, una adición de H2O2 presumiblemente también conduciría a un daño de N1b en el complejo mitocondrial I.
Accesibilidades superficiales para H2O2 de los grupos N1a y N1b en E. coli y O. aries. Los canales de superficie se probaron con CAVER 3.0.3 en PDB ID 7AWT (E. coli) y 7ZD6 (O. aries). Las distancias de los átomos de revestimiento a los centros de los canales en las constricciones se proporcionan y además se indican con guiones. (A,B) Canales de disolvente que conducen a N1b en E. coli (A) y O. aries (B). Los diámetros proporcionados son estrechos, aunque presumiblemente suficientes para permitir el paso de H2O2 a N1b con 2,28 Å en E. coli y 2,26 Å en O. aries. Tenga en cuenta que en el complejo I de O. aries, R53 de NDUFS1 bloquea una vía directa al clúster. La distancia lineal de N1b a la superficie accesible del disolvente asciende a 4,9 Å (E. coli) y 8,2 Å (O. aries), respectivamente (no indicado). (C,D) La accesibilidad de H2O2 de N1a está restringida con diámetros de canal de 1,98 Å (E. coli) y 1,90 Å (O. aries). Los átomos apolares en las constricciones repelen eficientemente las moléculas polares. La distancia mínima de los átomos de hierro N1a a la superficie es de 7,3 Å (E. coli) y 9,3 Å (O. aries), respectivamente (no indicado).
Se ha informado previamente que el H2O2 no tiene efecto sobre la actividad del complejo I de E. coli42. Sin embargo, no se mostraron datos y solo se mencionó que 5 mM de H2O2 no disminuyen su actividad. A partir de estos datos se concluyó que el H2O2 no oxida los grupos de Fe/S del complejo I42. Aquí, mostramos que la incubación de membranas de E. coli con H2O2 5 mM conduce a una inhibición pequeña pero significativa de la actividad de la NADH oxidasa, cuando se produce en exceso el complejo I. La mitad de la inhibición máxima se logra con H2O2 13,5 mM (Fig. 1B). La inhibición de la actividad NADH/ferricianuro oxidorreductasa mostró un curso de actividad similar con una IC50 de H2O2 14,4 mM (Fig. 1A). Sin embargo, la incubación de FMN y NADH libres con H2O2 20 mM no conduce a su modificación química (consulte la Fig. S4 complementaria). A partir de esto, proponemos que la disminución de las actividades de NADH oxidasa y NADH/ferricianuro oxidorreductasa a altas concentraciones de H2O2 (Fig. 1A, B) probablemente se deba a una oxidación de proteínas inespecífica45.
Sin embargo, en contraste con la suposición de que el H2O2 no tiene efecto sobre el grupo Fe/S del complejo42, mostramos experimentalmente por espectroscopía EPR que la adición de 1 mM de H2O2 conduce a la degradación oxidativa del grupo binuclear N1b en la subunidad NuoG (Fig. . 2). Los cálculos de las tasas de transferencia de electrones intramoleculares revelaron que la transferencia de electrones del grupo N3 al N4 a través del grupo N1b se puede omitir fácilmente mediante la transferencia directa de electrones del grupo N3 al N4, ambos ubicados en NuoG (Fig. 4)46,47. En este caso, la flavina reducida transferirá sus electrones secuencialmente al grupo N3 como en el complejo no tratado. Aquí, los electrones tendrán una parada transitoria secuencial antes de aparecer en los grupos N4 y N547. La distancia de borde a borde entre N3 y N4 es de 14,9 Å, lo que teóricamente conduce a una tasa de transferencia de electrones intramolecular 10 veces menor en general46,47. Esto no cambiará la tasa de transferencia de electrones general de NADH a Q, ya que la reducción y liberación de Q es mucho más lenta que la transferencia de electrones intramolecular a lo largo de los grupos de Fe/S43. Recientemente, generamos una variante del complejo I que carecía del grupo N1b mediante la eliminación de la proteína transportadora BolA48 del grupo de hierro y azufre de E. coli. La falta del grupo N1b condujo al ensamblaje de un complejo activo. Es importante destacar que la pérdida de N1b no afectó la actividad de la NADH oxidasa de las membranas mutantes, lo que significa que la falta de N1b no alteró la tasa de transferencia de electrones general de NADH a Q48.
Esquema que muestra la disposición de los grupos de Fe/S en el módulo de entrada de electrones del complejo I de E. coli. Se muestran las posiciones relativas de los grupos N1a (NuoE), N3 (NuoF) y N1b, N4 y N5 (todos NuoG). Las flechas indicaban posibles vías de transferencia de electrones. Las distancias de borde a borde entre los grupos en Å se indican en las flechas respectivas. La falta de N1b puede evitarse mediante la transferencia directa de electrones de N3 a N4 (rojo; nomenclatura según 59).
El daño oxidativo de N1b por H2O2 fue inesperado ya que los grupos de Fe/S del complejo I están bien enterrados dentro de la proteína. Sin embargo, el canal corto identificado con el programa CAVER allana el camino para que el H2O2 pase de la superficie de la proteína al grupo N1b en el complejo bacteriano y mitocondrial I (Fig. 3). Mirando la estructura general del complejo, parece que el grupo N1a en NuoE está más expuesto al medio acuoso (Fig. 3). Por otro lado, el entorno proteico de N1a es más hidrofóbico que el de los otros grupos. De hecho, CAVER identificó un canal con un diámetro de 1,98 Å en E. coli y 1,9 Å en el complejo ovino I, respectivamente (Fig. 3C, D) que va desde la superficie de la proteína directamente a N1a. Sorprendentemente, sin embargo, este canal está revestido con átomos apolares en las respectivas constricciones. Lo más probable es que esta superficie hidrofóbica del canal evite que el H2O2 dañe también el grupo N1a.
En conjunto, nuestros datos muestran claramente que las concentraciones fisiológicas de H2O2 no dañan los grupos de Fe/S del complejo respiratorio I. Además, las concentraciones elevadas dañan específicamente el grupo N1b. Sin embargo, el daño de N1b no afecta la actividad del complejo I, ya que este grupo puede pasarse por alto durante la transferencia de electrones intramoleculares, preservando así la actividad fisiológica del complejo.
Se usó un derivado de la cepa BW2511349 de E. coli, cromosómicamente carente del gen ndh, como huésped para sobreproducir el complejo I48. El nuo-operón cromosómico de esta cepa fue reemplazado por un cartucho de resistencia (nptII). La cepa huésped se transformó con el plásmido pBADnuoHis que codifica el nuo-operón50 completo. La expresión del nuo-operón se indujo mediante la adición de l-arabinosa al 0,2% (p/v). Para la preparación de proteínas, las células se cultivaron a 37 °C en un medio rico en autoinducción que contenía 34 µg/mL de cloranfenicol mientras se agitaba a 180 rpm51. De acuerdo con la configuración experimental, todas las actividades inducidas por NADH de las membranas de la cepa transformada se originan a partir de la actividad catalítica del complejo I sobreproducido codificado por el plásmido.
Las células se recogieron por centrifugación, se suspendieron en MES/NaOH 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0 (tampón A) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM y unos pocos granos de ADNseI y se rompieron mediante tres pases a través de un HPL-6 (Maximator, 1000–1500 bar)51. Las membranas citoplasmáticas se obtuvieron mediante centrifugación diferencial51 y se suspendieron en un volumen igual (1:1, p/v) de tampón A con MgCl2 5 mM y PMSF 0,1 mM.
El complejo se preparó como se describe52. En resumen, las proteínas de membrana se extrajeron con lauril maltosa neopentilglicol al 2 % (p/v) (LMNG; concentración final), el extracto aclarado se ajustó a imidazol 20 mM y se aplicó a una columna ProBond Ni2+-IDA de 35 ml (Invitrogen) equilibrada en tampón A con MgCl2 5 mM, glicerol al 10 % (v/v), LMNG al 0,005 % (p/v) e imidazol 20 mM a pH 6,8. Las proteínas unidas se eluyeron con el mismo tampón que contenía imidazol 308 mM. Las fracciones que contenían actividad NADH/ferricianuro oxidorreductasa se agruparon, se concentraron por ultrafiltración en dispositivos de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 MWCO de 100 kDa (Millipore) y se pulieron usando una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superose 6 (300 ml, GE Healthcare) equilibrada en tampón A con 5 MgCl2 mM, glicerol al 10 % (v/v) y LMNG al 0,005 % (p/v). Las fracciones con mayor actividad NADH/ferricianuro oxidorreductasa se usaron para estudios adicionales.
Los ensayos de actividad se realizaron a 30 °C. La actividad NADH oxidasa de las membranas citoplasmáticas se determinó con un electrodo de oxígeno tipo Clarke (DW1; Hansatech) como se describe51. El electrodo se calibró agregando unos pocos granos de ditionito de sodio al tampón saturado con aire51. La actividad NADH/ferricianuro oxidorreductasa se determinó como una disminución de la absorbancia del ferricianuro a 410 nm con un espectrómetro de matriz de diodos (cubeta QS, d = 1 cm, Hellma; TIDAS II, J&M Aalen) usando un ε de 1 mM−1 cm− 153. El ensayo se realizó en tampón A que contenía ferricianuro 1 mM y NADH 0,2 mM. La reacción se inició mediante la adición de la proteína y la velocidad de la reacción enzimática se corrigió por el valor de la reacción no enzimática. La actividad de NADH:decil-Q oxidorreductasa se midió como disminución de la concentración de NADH a 340 nm utilizando un ε de 6,3 mM−1 cm−1 (cubeta QS, d = 1 cm, Hellma; TIDAS II, J&M Aalen). El complejo I purificado se mezcló en una proporción de 1:1 (p/p) con lípidos polares de E. coli (10 mg mL−1; Avanti) y se incubó en hielo durante 30 min. El ensayo contenía decil-Q 60 µM, 2 µg de complejo I y un exceso molar diez veces mayor (5 µg) de citocromo bo3 oxidasa de E. coli en tampón A con MgCl2 5 mM, glicerol al 10 % (v/v) y 0,005 % (p/v). v) LMNG. La reacción se inició mediante la adición de NADH46 150 µM. Se agregaron diferentes concentraciones de H2O2 (30 %, v/v; Chemsolute) a los ensayos justo antes del comienzo de la reacción.
Para determinar la reversibilidad de la inhibición de H2O2, las membranas se incubaron durante 5 min con H2O2 20 mM. Se centrifugaron alícuotas de membranas tratadas y no tratadas (178 000 g, 4 °C, 60 min, rotor 60Ti, ultracentrífuga Sorvall wX +, Thermo Scientific) y se resuspendieron en el tampón A de diez veces el volumen con MgCl2 5 mM y 0,1 mM PMSF. Este procedimiento se repitió dos veces y se determinó la actividad NADH/ferricianuro y NADH oxidasa de ambas muestras.
Las mediciones de EPR se realizaron con un espectrómetro EMX 6/1 (Bruker) que operaba en la banda X. La temperatura de la muestra se controló con un criostato de flujo de helio ESR-9 (Oxford Instruments). Los espectros se registraron a 40 K y 2 mW de potencia de microondas ya 13 K y 5 mW de potencia de microondas de 300 a 380 mT. Otras condiciones de EPR fueron: frecuencia de microondas, 9.360 GHz; amplitud de modulación, 0,6 mT; constante de tiempo, 0,164 s; velocidad de exploración, 17,9 mT min−1. Se redujeron 300 µL del complejo I (2.5–3.5 mg mL−1) en tampón A con un exceso molar de 2000 veces de NADH (10–14 mM) y se congelaron a 150 K en 2-metilbutano/metilciclohexano (1:5; v: v).
Para determinar si el H2O2 se oxida o daña el grupo N1b, se incubó el complejo I con H2O2 1 mM durante 5 min. El exceso de H2O2 se eliminó concentrando la muestra por ultrafiltración (Amicon Ultra-15, MWCO: 100 kDa, Millipore; 3800 g, 4 °C, rotor A-4-44, centrífuga 5804R, Eppendorf) y posterior dilución diez veces en tampón A con MgCl2 5 mM, glicerol al 10 % (v/v) y LMNG al 0,005 % (p/v). Este procedimiento se repitió dos veces. Se registró un espectro EPR de la muestra concentrada reducido por un exceso molar de NADH de 2000 veces.
La accesibilidad a los disolventes de los grupos de Fe/S de E. coli y el complejo ovino I se probó con el complemento PyMOL CAVER (versión 3.0.3)54,55 con radios mínimos de 0,90–1,20 Å utilizando el modelo 7AWT de pdb del brazo periférico que contiene todos los clusters44 y el pdb modelo 7ZD6 del complejo ovino I36.
La concentración de proteína se determinó según el método de biuret utilizando BSA como patrón56. La concentración del complejo I purificado se determinó mediante espectroscopia UV/vis (TIDAS II, J&M Aalen) utilizando un ε de 781 mM−1 cm−1 derivado de la secuencia de aminoácidos57. Se realizó SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) con un gel de separación al 10 % y un gel de apilamiento al 3,9 %58. Se ensayó una posible oxidación de FMN y NADH por H2O2 mediante análisis LC-MS. FMN 1 mM y NADH 1 mM (ambos de Sigma Aldrich) en tampón A se incubaron con H2O2 20 mM durante 30 min a temperatura ambiente y luego se sometieron a HPLC (ProntoSIL 120-3-C18; AQ plus; 1 mL, 150 × 3,0 mm) a un caudal de 0,5 mL min−1 en acetato de trietilamonio al 10 % (100 mM) y agua al 90 %. Después de 1 min, se aplicó un gradiente de 10 a 90 % de acetonitrilo durante 17 min. Las muestras eluidas se analizaron directamente mediante API-MS (Dionex MSQ Plus).
Los datos que respaldan los hallazgos de este artículo están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.
Hirst, J. Complejo mitocondrial I. Annu. Rev. Bioquímica. 82, 551–575 (2013).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Kaila, VRI Resolución de la dinámica química en la conversión de energía biológica: transferencia de electrones acoplados a protones de largo alcance en el complejo respiratorio I. Acc. química Res. 54, 4462–4473 (2021).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Sazanov, LA Una bomba de protones molecular gigante: Estructura y mecanismo del complejo respiratorio I. Nat. Rev Mol. Biol celular. 16, 375–388 (2015).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Parey, K., Wirth, C., Vonck, J. y Zickermann, V. Complejo respiratorio I: estructura, mecanismo y evolución. actual Opinión Estructura. Biol. 63, 1–9 (2018).
Artículo Google Académico
Cabrera-Orefice, A. et al. El bloqueo del movimiento del bucle en el bolsillo de ubiquinona del complejo I desactiva las bombas de protones. Nat. común 9, 4500 (2018).
Artículo PubMed PubMed Central ADS Google Scholar
Gnandt, E., Dörner, K., Strampraad, MFJ, de Vries, S. y Friedrich, T. La multitud de grupos de hierro y azufre en el complejo respiratorio I. Biochim. Biografía. Acta 1857, 1068-1072 (2016).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Agip, A.-NA, Blaza, JN, Fedor, JG & Hirst, J. Complejo respiratorio de mamíferos I a través de la lente de Cryo-EM. año Rev. Biophys. 48, 165–184 (2019).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Fiedorczuk, K. et al. Estructura atómica de todo el complejo respiratorio de los mamíferos I. Nature 538, 406–410 (2016).
Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar
Baradaran, R., Berrisford, JM, Minhas, GS y Sazanov, LA Estructura cristalina de todo el complejo respiratorio I. Nature 494, 443–448 (2013).
Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar
Kravchuk, V. et al. Un mecanismo de acoplamiento universal del complejo respiratorio I. Nature 609, 808–814 (2022).
Artículo CAS PubMed ANUNCIOS Google Académico
Weidner, U. et al. El locus del gen de la NADH: ubiquinona oxidorreductasa translocadora de protones en Escherichia coli. Organización de los 14 genes y relación entre las proteínas derivadas y las subunidades del complejo mitocondrial IJ Mol. Biol. 233, 109–122 (1993).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Braun, M., Bungert, S. & Friedrich, T. Caracterización del fragmento de NADH deshidrogenasa producido en exceso de la NADH: ubiquinona oxidorreductasa (complejo I) de Escherichia coli. Bioquímica 37, 1861–1867 (1998).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Ernster, L. et al. Estereoespecificidad de ciertas preparaciones solubles y en partículas de nicotinamida-adenina dinucleótido deshidrogenasa mitocondrial reducida de corazón de res. Naturaleza 207, 940–941 (1965).
Artículo CAS PubMed ANUNCIOS Google Académico
Nuber, F. et al. Un anión de quinol como translocación de protones de acoplamiento intermedio catalítico con transferencia de electrones en el complejo I de E. coli. Frente. química 9, 672969 (2021).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Friedrich, T. et al. Caracterización de dos nuevos grupos redox en la NADH: ubiquinona oxidorreductasa respiratoria (complejo I). bioquimica Biografía. Acta 1459, 305–309 (2000).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Kaila, VRI Transferencia de electrones acoplados a protones de largo alcance en la conversión de energía biológica: hacia la comprensión mecanicista del complejo respiratorio IJR Soc. Interfaz 15, 20170916 (2018).
Artículo PubMed PubMed Central Google Académico
Kussmaul, L. & Hirst, J. El mecanismo de producción de superóxido por NADH: ubiquinona oxidorreductasa (complejo I) de mitocondrias de corazón bovino. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 103, 7607–7612 (2006).
Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar
Pryde, KR & Hirst, J. El superóxido es producido por la flavina reducida en el complejo mitocondrial I: un mecanismo único y unificado que se aplica durante la transferencia de electrones directos e inversos. J. Biol. química 286, 18056–18065 (2011).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Galkin, A. & Brandt, U. Formación de radicales superóxido por complejo I puro (NADH: ubiquinona oxidorreductasa) de Yarrowia lipolytica. J. Biol. química 280, 30129–30135 (2005).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Frick, K., Schulte, M. y Friedrich, T. Producción de especies de oxígeno reactivo por el complejo respiratorio I de Escherichia coli. Bioquímica 54, 2799–2801 (2015).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Balaban, RS, Nemoto, S. & Finkel, T. Mitochondria, oxidantes y envejecimiento. Celda 120, 483–495 (2005).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Boveris, A. & Chance, B. La generación mitocondrial de peróxido de hidrógeno. Efectos y propiedades generales del oxígeno hiperbárico. Bioquímica J. 134, 707–716 (1973).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Chance, B., Sies, H. & Boveris, A. Metabolismo de hidroperóxido en órganos de mamíferos. Fisiol. Rev. 59, 527–605 (1979).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Turrens, JF Formación mitocondrial de especies reactivas de oxígeno. J. Physiol. 552, 335–344 (2003).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Murphy, MP Cómo las mitocondrias producen especies reactivas de oxígeno. Bioquímica J. 417, 1–13 (2009).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Collins, Y. et al. Señalización redox mitocondrial de un vistazo. J. celular. ciencia 125, 801–806 (2012).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Finkel, T. Transducción de señales por especies reactivas de oxígeno. J. celular. Biol. 194, 7–15 (2011).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Arias-Mayenco, I. et al. Detección aguda de O2: papel de la relación coenzima QH2/Q y la compartimentación mitocondrial de ROS. Metab. celular 28, 145–158 (2018).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Paradis, M. et al. La proteína ER Creld regula la dinámica de contacto ER-mitocondrias y la actividad del complejo respiratorio 1. ciencia Adv. 8, eabo0155 (2022).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Imlay, JA Grupos de hierro y azufre y el problema con el oxígeno. mol. Microbiol. 59, 1073–1082 (2006).
Artículo PubMed Google Académico
Imlay, JA Los mecanismos moleculares y las consecuencias fisiológicas del estrés oxidativo: Lecciones de una bacteria modelo. Nat. Rev. Microbiol. 11, 443–454 (2013).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Chung, I. et al. Las estructuras crio-EM definen la unión de ubiquinona-10 al complejo mitocondrial I y las transiciones conformacionales que acompañan a la ocupación del sitio Q. Nat. común 13, 2758 (2022).
Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar
Gu, J., Liu, T., Guo, R., Zhang, L. y Yang, M. El mecanismo de acoplamiento del complejo mitocondrial de mamíferos I. Nat. Estructura. mol. Biol. 29, 172–182 (2022).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Parey, K. et al. Estructura y dinámica de alta resolución del complejo mitocondrial I-Insights en el mecanismo de bombeo de protones. ciencia Adv. 7, eabj3221 (2021).
Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar
Grba, DN & Hirst, J. La estructura del complejo mitocondrial I revela moléculas de agua ordenadas para catálisis y translocación de protones. Nat. Estructura. mol. Biol. 27, 892–900 (2020).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kampjut, D. & Sazanov, LA El mecanismo de acoplamiento del complejo respiratorio de mamíferos I. Science 370, eabc4209 (2020).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Popović-Bijelić, A. et al. Daño del grupo de hierro y azufre por el radical superóxido en los tejidos neurales del modelo de rata SOD1 (G93A) ALS. Radico libre. Biol. Medicina. 96, 313–322 (2016).
Artículo PubMed Google Académico
Esterházy, D., King, MS, Yakovlev, G. & Hirst, J. Producción de especies reactivas de oxígeno por el complejo I (NADH: ubiquinona oxidorreductasa) de Escherichia coli y comparación con la enzima de las mitocondrias. Bioquímica 47, 3964–3971 (2008).
Artículo PubMed Google Académico
Birrell, JA, Yakovlev, G. & Hirst, J. Reacciones del mononucleótido de flavina en el complejo I: un mecanismo combinado describe la oxidación de NADH junto con la reducción de APAD+, ferricianuro u oxígeno molecular. Bioquímica 48, 12005–12013 (2009).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Seaver, LC e Imlay, JA ¿Son las enzimas respiratorias las principales fuentes de peróxido de hidrógeno intracelular?. J. Biol. química 279, 48742–54850 (2004).
Artículo CAS PubMed Google Académico
González-Flecha, B. & Demple, B. Fuentes metabólicas de peróxido de hidrógeno en Escherichia coli en crecimiento aeróbico. J. Biol. química 270, 13681–13687 (1995).
Artículo PubMed Google Académico
Jang, S. & Imlay, JA El peróxido de hidrógeno intracelular micromolar interrumpe el metabolismo al dañar las enzimas de hierro y azufre. J. Biol. química 282, 929–937 (2007).
Artículo CAS PubMed Google Académico
De Vries, S., Dörner, K., Strampraad, MFJ y Friedrich, T. Las tasas de tunelización de electrones en el complejo I están ajustadas para una conversión de energía eficiente. Angew. química En t. ed. 54, 2844–2848 (2015).
Artículo Google Académico
Schimpf, J. et al. Estructura del brazo periférico de un complejo respiratorio minimalista I. Estructura 30, 80-94.e4 (2022).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Davies, MJ Oxidación y peroxidación de proteínas. Bioquímica J. 473, 805–825 (2016).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Page, CC, Moser, CC, Chen, X. & Dutton, PL Principios de ingeniería natural del túnel de electrones en la oxidación-reducción biológica. Naturaleza 402, 47–52 (1996).
Artículo ANUNCIOS Google Académico
Moser, CC, Farid, TA, Chobot, SE y Dutton, PL Cadenas de túneles de electrones de las mitocondrias. bioquimica Biografía. Acta 1757, 1096-1109 (2006).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Burschel, S. et al. Proteínas transportadoras de grupos de hierro y azufre involucradas en el ensamblaje de Escherichia coli NADH: ubiquinona oxidorreductasa (complejo I). mol. Microbiol. 111, 31–45 (2019).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Datsenko, KA & Wanner, BL Inactivación en un solo paso de genes cromosómicos en Escherichia coli K-12 usando productos de PCR. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 97, 6640–6645 (2000).
Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar
Pohl, T., Uhlmann, M., Kaufenstein, M. y Friedrich, T. Mutagénesis mediada por Lambda Red y purificación por afinidad a gran escala eficiente de la NADH: ubiquinona oxidorreductasa (complejo I) de Escherichia coli. Bioquímica 46, 10694–10702 (2007).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Nuber, F. et al. Consecuencias bioquímicas de dos mutaciones del gen ND clínicamente relevantes en el complejo respiratorio I de Escherichia coli. Sci. Rep. 11, 12641 (2021).
Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar
Hoeser, F. et al. El complejo respiratorio I con simetría de carga en el brazo de la membrana bombea protones. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 119, e2123090119 (2022).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Friedrich, T. et al. Una pequeña isoforma de NADH: ubiquinona oxidorreductasa (complejo I) sin subunidades codificadas mitocondrialmente se produce en Neurospora crassa tratada con cloranfenicol. EUR. J. Bioquímica. 180, 173–180 (1989).
Artículo CAS PubMed Google Académico
PyMOL. Nueva York, NY: PyMOL Molecular, Graphics System, LLC. https://pymol.org/2/ (2022).
Chovancova, E. et al. CAVER 3.0: Una herramienta para el análisis de vías de transporte en estructuras dinámicas de proteínas. Cómputo PLoS. Biol. 8, e1002708 (2012).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Gornall, AG, Bardawill, CJ & David, MM Determinación de proteínas séricas mediante la reacción de biuret. J. Biol. química 177, 751–766 (1949).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Gill, SC & von Hippel, PH Cálculo de coeficientes de extinción de proteínas a partir de datos de secuencias de aminoácidos. Anal. Bioquímica 182, 319–326 (1989).
Artículo CAS PubMed Google Académico
Schägger, H. & von Jagow, G. Electroforesis en gel de tricina-dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida para la separación de proteínas en el rango de 1 a 100 kDa. Anal. Bioquímica 166, 368–379 (1987).
Artículo PubMed Google Académico
Ohnishi, T. & Nakamaru-Ogiso, E. ¿Hubo "asignaciones incorrectas" entre los grupos de hierro y azufre N4, N5 y N6b en la NADH-quinona oxidorreductasa (complejo I)?. bioquimica Biografía. Acta 1777, 703–710 (2008).
Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Descargar referencias
Este trabajo fue apoyado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) por Grants 278002225/RTG 2202 y SPP1927; FR 1140/11-2 a TF.
Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.
Instituto de Bioquímica, Albert-Ludwigs-University Freiburg, Albertstr. 21, 79104, Friburgo, Alemania
Lisa Strotmann, Caroline Harter, Tatjana Gerasimova, Daniel Wohlwend y Thorsten Friedrich
Instituto de Química Orgánica, Albert-Ludwigs-University Freiburg, Albertstr. 21, 79104, Friburgo, Alemania
Kevin Ritter y Henning J. Jessen
También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar
También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar
También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar
También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar
También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar
También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar
También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar
LS, CH y TG purificaron la proteína, LS realizó las mediciones de actividad y adquirió los datos, TF registró los espectros de EPR, DW realizó los cálculos, KR y HJJ registraron los datos de LC-MS, todos los autores analizaron los datos. TF escribió el manuscrito con la ayuda de todos los autores, TF diseñó el estudio.
Correspondencia a Thorsten Friedrich.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Reimpresiones y permisos
Strotmann, L., Harter, C., Gerasimova, T. et al. H2O2 daña selectivamente el grupo binuclear de hierro y azufre N1b del complejo respiratorio I. Sci Rep 13, 7652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34821-5
Descargar cita
Recibido: 08 febrero 2023
Aceptado: 08 mayo 2023
Publicado: 11 mayo 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34821-5
Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:
Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.
Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt
Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.