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May 13, 2023

C11orf54 promueve la reparación del ADN mediante el bloqueo de CMA

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 606 (2023) Citar este artículo

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C11orf54 es una hidrolasa de éster altamente conservada en diferentes especies. C11orf54 se ha identificado como una proteína biomarcadora de cánceres renales, pero su función exacta sigue siendo poco conocida. Aquí demostramos que la eliminación de C11orf54 disminuye la proliferación celular y mejora el daño y la apoptosis del ADN inducidos por cisplatino. Por un lado, la pérdida de C11orf54 reduce la expresión de Rad51 y la acumulación nuclear, lo que da como resultado la supresión de la reparación por recombinación homóloga. Por otro lado, C11orf54 y HIF1A interactúan competitivamente con HSC70, la eliminación de C11orf54 promueve la unión de HSC70 a HIF1A para apuntar a la degradación a través de la autofagia mediada por chaperonas (CMA). La degradación de HIF1A mediada por la eliminación de C11orf54 reduce la transcripción de la subunidad reguladora M2 de la ribonucleótido reductasa (RRM2), que es una enzima RNR limitante de la velocidad para la síntesis y reparación del ADN mediante la producción de dNTP. El suplemento de dNTP puede rescatar parcialmente el daño del ADN y la muerte celular mediados por la eliminación de C11orf54. Además, encontramos que la bafilomicina A1, un inhibidor tanto de la macroautofagia como de la autofagia mediada por chaperonas, muestra efectos de rescate similares a los del tratamiento con dNTP. En resumen, descubrimos un papel de C11orf54 en la regulación del daño y la reparación del ADN a través de la disminución mediada por CMA del eje HIF1A/RRM2.

La integridad genómica es crucial en el mantenimiento de la homeostasis, el desarrollo normal y la prevención del cáncer1. Tanto el estrés genómico endógeno como el exógeno provocan roturas de una sola hebra (SSB) y roturas de doble hebra (DSB) del ADN, lo que lleva a una respuesta activa al daño del ADN (DDR)2,3. Las vías DDR detectan, señalizan y reparan diferentes tipos de daños en el ADN, lo cual es crucial para mantener la estabilidad genómica4. La recombinación homóloga (HR) representa el mecanismo principal para la reparación dirigida por homología sin errores de DSB y entrecruzamientos entre hebras (ICL). El Rad51 y sus parálogos juegan un papel esencial en este proceso5,6. La ribonucleótido reductasa (RNR) cataliza los desoxirribonucleótidos (dNTP) necesarios para la síntesis de ADN. Las dos subunidades RRM1 (subunidad catalítica de ribonucleótido reductasa M1) y RRM2 (subunidad reguladora de ribonucleótido reductasa M2) constituyen el complejo α2β2 para ejercer actividad catalítica, y el equilibrio de los dNTP dentro de las células es vital para la homeostasis celular y el mantenimiento de la integridad genómica7,8,9. La enzima RNR limitante de la velocidad, RRM2, es esencial para la síntesis y reparación del ADN mediante la producción de dNTPs10.

El factor 1 inducible por hipoxia (HIF1) es un complejo transcripcional dimérico que participa en muchos procesos biológicos como el metabolismo, la inflamación y la tumorigénesis11. HIF1A es una subunidad del complejo HIF1, que fue modificada por prolil-hidroxilasas (PHD) específicas de HIF en presencia de O2. HIF1A modificado es degradado por el proteasoma, que requiere hidroxilación de prolina dependiente de oxígeno y ubiquitinación mediada por von Hippel-Lindau (VHL)12. Además, se informó que HIF1A regula DDR de varias maneras. P-H2A.X es un marcador de roturas de doble cadena de ADN para amplificar la señal de daño y recluta proteínas de reparación de daños en el ADN13. En las células cancerosas, la eliminación de HIF1A reduce la acumulación de p-H2A.X inducida por hipoxia y luego afecta la capacidad de reparación del daño en el ADN y la resistencia a la terapia tumoral14. La estabilización de HIF1A mediada por hipoxia promueve la transcripción de hTERT (telomerasa transcriptasa inversa) y hTR (componente de ARN de telomerasa) y luego regula el daño del ADN y la estabilidad genómica15,16. Mientras tanto, la pérdida de HIF1A podría frenar la reparación de roturas de doble cadena del ADN y ser más sensible a la quimioterapia17,18.

La autofagia mediada por chaperonas (CMA) es un tipo de autofagia en la que los sustratos se dirigen directamente al lisosoma para su degradación. Las proteínas sustrato de CMA son reconocidas selectivamente por la proteína afín de choque térmico de 70 kDa (HSC70) y se dirigen a los lisosomas, luego se reclutan para el receptor de membrana lisosomal tipo 2A (LAMP2A) para la degradación mediada por CMA19. CMA participa en la reparación del ADN y puede prevenir la transformación maligna al mantener la estabilidad del genoma19. Estudios recientes demostraron que HIF1A es un sustrato de CMA y está involucrado en la regulación del ciclo celular. HIF1A se degrada de manera dependiente de CMA cuando se ubiquitila en Lys63 por la ubiquitina-proteína ligasa E3 STUB120. El punto de control quinasa 1 (CHK1), el regulador del ciclo celular, es otro sustrato de CMA. La inhibición de CMA provoca la persistencia nuclear de Chk1 durante la respuesta al daño del ADN, lo que lleva a la acumulación de daño al ADN y al deterioro de la reparación del ADN21.

C11orf54 (cromosoma 11 marco de lectura abierto 54), también conocido como PTD012, es un gen altamente conservado expresado en Mus musculus, Brachydanio rerio, Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans22. El C11orf54 humano contiene un ion Zn2+ coordinado con tres residuos de histidina y exhibe actividad de éster hidrolasa22. Además, el ortólogo de C11orf54 de Drosophila melanogaster desempeña un papel fundamental en la homeostasis de las proteínas durante la sobrenutrición23. C11orf54 se identificó como una proteína biomarcadora de cáncer de endometrio, carcinoma de células renales y carcinoma de células renales de células claras mediante electroforesis en gel bidimensional junto con espectrometría de masas24,25,26. Sin embargo, su función en los mamíferos aún no está clara.

En el presente estudio, encontramos que C11orf54 regulaba la proliferación celular y la apoptosis. La eliminación de C11orf54 activó la respuesta al daño del ADN (DDR) dependiente de ATM e inhibió la reparación de la recombinación homóloga al reprimir la expresión de Rad51. Además, encontramos que C11orf54 interactuaba competitivamente con HSC70, lo que interrumpía la interacción entre HIF1A y HSC70. Por lo tanto, la eliminación de C11orf54 mejoró la unión de HSC70 a HIF1A, lo que condujo a la degradación de HIF1A a través de la autofagia mediada por chaperonas. Además, el bloqueo de CMA por bafilomicina A1 (BafA1) podría recuperar parcialmente el daño del ADN inducido por la caída de C11orf54 y la supresión de la proliferación celular. Nuestros datos demostraron que C11orf54 promueve la reparación del ADN bloqueando la degradación de HIF1A mediada por CMA.

La estructura cristalina de C11orf54 lo reveló como una hidrolasa de éster, que podría pertenecer a la superfamilia de proteínas de plegamiento de metalo-β-lactamasas22. C11orf54 se conserva entre especies, incluidas Homo sapiens, Mus musculus, Brachydanio rerio, Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans. C11orf54 se expresa universal entre diferentes tejidos en especies humanas, especialmente enriquecido en tejidos renales y hepáticos (Fig. 1 complementaria). Por lo tanto, usamos 293T y hepatocitos para investigar la función fisiológica de C11orf54.

Un estudio anterior demostró que C11orf54 se localiza predominantemente en el núcleo utilizando un enfoque de fenotipado automático27. En otro estudio, se detectó C11orf54 en el citoplasma y el núcleo de células con sobreexpresión de C11orf5428. Para estudiar la localización subcelular exacta de C11orf54 endógeno, realizamos el ensayo de fraccionamiento nuclear/citosólico y el experimento de inmunotinción utilizando los anticuerpos verificados. Primero, generamos células de eliminación de C11orf54 utilizando dos silenciadores de genes mediados por shRNA diferentes (shC11orf54-1, shC11orf54-2). Los niveles de proteína y ARNm de C11orf54 se redujeron significativamente en las células de eliminación de C11orf54 (Fig. 1a, b). Luego, sobreexpresamos C11orf54 en las células eliminadas para verificar la especificidad de los anticuerpos C11orf54 (Fig. 1c). La ausencia de transferencias indicó una construcción exitosa de la línea celular de eliminación de C11orf54 y también validó la especificidad del anticuerpo C11orf54. Los experimentos de inmunotinción mostraron que el C11orf54 endógeno estaba predominantemente localizado en el citoplasma (Fig. 1d, e). Además, el ensayo de fraccionamiento nuclear/citosol mostró resultados consistentes de que C11orf54 se observó principalmente en el fraccionamiento del citoplasma (Fig. 1f, g). Estos datos sugieren colectivamente que C11orf54 se localiza predominantemente en el citoplasma.

Los experimentos a, b Western blot (a) y qPCR (b) indican la eficiencia de eliminación de C11orf54 (shC11orf54-1, shC11orf54-2) en la línea celular PLC/PRF/5. Se utilizó ACTB como control (n = 3 réplicas biológicas, los datos se presentan como valores medios ± DE, ***p < 0,001). c Western blot indica la especificidad del anticuerpo C11orf54 en las células silenciadas C11orf54 y la reintroducción de C11orf54 en las células silenciadas C11orf54. d Las imágenes de inmunotinción representativas confirman la localización subcelular de C11orf54 en células de tipo salvaje. Barra de escala = 20 μm. e Las imágenes de inmunotinción representativas confirman la localización subcelular de C11orf54 en el control y las células PLC/PRF/5 eliminadas de C11orf54. Barra de escala = 10 μm. f, g El ensayo de fraccionamiento nuclear/citosol muestra la localización subcelular de C11orf54 en la línea celular PLC/PRF/5 con dos anticuerpos verificados de Proteintech (f) e Invitrogen (g). Se utilizó GAPDH como marcador de citoplasma (Cyto) y H3 como marcador de núcleo (Nuc).

A continuación, investigamos si la eliminación de C11orf54 afecta la proliferación celular y la apoptosis, que son eventos celulares clave en el desarrollo de organismos29. El ensayo CCK8 mostró que el silenciamiento de C11orf54 inhibía significativamente el crecimiento de células PLC/PRF/5 y 293T (Fig. 2a; Fig. 2a complementaria) y la formación de colonias (Fig. 2b, c y Fig. 2b, c complementaria). Además, detectamos un número significativamente reducido de células positivas para EdU en la célula de eliminación de C11orf54 en comparación con la célula de control (Fig. 2d, e). Estos resultados indican que la deficiencia de C11orf54 suprime la proliferación celular.

un ensayo CCK8 muestra la supervivencia celular del control y las células PLC/PRF/5 eliminadas de C11orf54 (los datos se presentan como valores medios ± SD, ***p < 0,001). b, c La formación de colonias (b) y los resultados cuantitativos (c) muestran el crecimiento celular del control y las células PLC/PRF/5 eliminadas de C11orf54 (n = 3 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± DE, *p < 0,05, ** p < 0,01). d, e La tinción con EdU confirma el efecto de la eliminación de C11orf54 en la proliferación celular en la línea celular PLC/PRF/5. Las imágenes muestran la tinción EdU (color rojo) combinada con la tinción DAPI (color azul). (Barra de escala = 100 μm; los datos se presentan como valores medios ± DE, ***p < 0,001). f, g Western blots (f) y resultados cuantitativos (g) de expresión de C11orf54 en células PLC/PRF/5 tratadas con cisplatino 10 μM durante diferentes tiempos (0 h, 1 h, 6 h, 12 h y 24 h) (n = 3 repeticiones biológicas; los datos se presentan como valores medios ± DE, ***p < 0,001). h Ensayo de viabilidad después de la incubación con cisplatino en células control y C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 a diferentes concentraciones (5 μM, 20 μM, 40 μM y 100 μM). i, j Análisis de formación de colonias de la eliminación de C11orf54 en la sensibilidad al cisplatino después del tratamiento con cisplatino 3 μM durante 24 h y cultivado en un medio libre de drogas durante otros 10 días (n = 3 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± SD, * ** p < 0,001). k, l Análisis de la apoptosis mediante tinción doble con anexina V (FITC)/yoduro de propidio (PI) (L) y resultados cuantitativos (K) en células de control y células inactivadas C11orf54 después del tratamiento con cisplatino 10 μM durante 48 h (n = 4 réplicas biológicas ; los datos se presentan como valores medios ± DE, ***p < 0,001). m, n Transferencias de Western (m) y resultados cuantitativos (n) de las proteínas indicadas en células de control y C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 después del tratamiento con 10 μM de cisplatino durante 48 h (n = 3 repeticiones biológicas; los datos se presentan como media valores ± DE, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Curiosamente, descubrimos que la expresión de C11orf54 aumentó con el tratamiento con cisplatino (CDDP) de una manera dependiente del tiempo (Fig. 2f, g). Para examinar si otros inductores genotóxicos podrían regular la expresión de C11orf54, evaluamos la expresión de C11orf54 tras el tratamiento con hidroxiurea (HU) y camptotecina (CPT). De manera similar, HU y CPT también podrían promover la expresión de C11orf54 de una manera dependiente del tiempo (Fig. 3a-d complementaria). Estos datos mostraron que C11orf54 podría responder a los inductores genotóxicos, lo que indica que C11orf54 puede desempeñar un papel en la muerte celular inducida por fármacos genotóxicos. De hecho, los ensayos de viabilidad celular y formación de colonias mostraron que las células eliminadas de C11orf54 eran más sensibles al cisplatino que las células de control (Fig. 2h-j). La tinción doble con anexina V (FITC) / yoduro de propidio (PI) mostró que la apoptosis de fase temprana y tardía inducida por cisplatino aumentó en las células de eliminación de C11orf54 (Fig. 2k, l). El ensayo TUNEL también demostró que la pérdida de C11orf54 promovió la apoptosis bajo el tratamiento con cisplatino (Figura complementaria 3e, f). Además, descubrimos que la eliminación de C11orf54 mejoró la división de caspasa 3 y PARP1, que desempeñan un papel central en la ejecución de la apoptosis (Fig. 2m, n). Curiosamente, el efecto de C11orf54 sobre la activación de caspasa3 parecía solo en presencia de cisplatino, lo que puede deberse a que el cisplatino aumenta la tendencia a la apoptosis después de la caída de C11orf54. Mientras tanto, se observó un aumento de BAX proapoptótico y una disminución de Bcl-2 antiapoptótico en las células de eliminación de C11orf54 (Fig. 2m, n). En conjunto, estos resultados demuestran que la deficiencia de C11orf54 suprime la proliferación celular y promueve la apoptosis.

Los fármacos genotóxicos provocan la muerte celular al inhibir la síntesis de ADN o romper la estructura del ADN. Nuestros resultados mostraron que el nivel de proteína de C11orf54 aumentó después del tratamiento con fármacos genotóxicos (Fig. 2f, g y Fig. 3a-d complementaria), lo que indica que C11orf54 puede estar involucrado en la estabilidad del genoma o el daño del ADN. Para examinar si C11orf54 participa en el daño del ADN inducido por fármacos, utilizamos un ensayo cometa para detectar roturas de doble cadena (DSB) después del tratamiento con cisplatino. Los fragmentos de ADN indicados por el ADN de la cola y el momento de la cola aumentaron drásticamente en las células eliminadas de C11orf54 después del tratamiento con cisplatino (Fig. 3a-c). Además, examinamos el nivel de γH2A.X (p-H2A.X-Ser139), que se reconoce como un marcador de daño en el ADN30, mediante tinción de inmunofluorescencia y ensayo de transferencia Western. El silenciamiento de C11orf54 aumentó significativamente el número de focos γH2A.X (Fig. 3d, e) y el nivel de proteína (Fig. 3f, g) tanto en condiciones normales como con cisplatino en comparación con las células de control. Estos resultados sugieren que la eliminación de C11orf54 promueve el daño del ADN.

a–c Imágenes representativas del ensayo del cometa en células control y C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 (a) y la cuantificación del % de ADN de la cola (b) y el momento de la cola (c) (n = 20 células independientes; los datos se presentan como media valores ± DE; ***p < 0,001). Barra de escala = 30 μm. d, e Imágenes representativas de focos de γH2A.X (d) y resultados cuantitativos (e) en células control y C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 (n = 10 células independientes; los datos se presentan como valores medios ± DE; *p < 0,05 , *** p < 0,001). Barra de escala = 10 μm. f, g Transferencias de Western (f) y resultados cuantitativos (g) de las proteínas indicadas en control y células PLC/PRF/5 eliminadas de C11orf54 tras el tratamiento con cisplatino 10 μM durante 6 h (n = 3 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± DE; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). h, i Western blot (h) y resultados cuantitativos (i) de las proteínas indicadas en control y células PLC/PRF/5 de eliminación de C11orf54 con cisplatino 10 μM y cisplatino 10 μM más KU-60019 10 μM durante 6 h (n = 3 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± DE; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

ATM (ataxia-telangiectasia mutada) es una de las quinasas más aguas arriba en la vía DDR, cuya activación puede desencadenar la fosforilación de una serie de quinasas como Chk1 y Chk231,32,33,34. Descubrimos que la eliminación de C11orf54 promovió la fosforilación de ATM y su Chk1 / Chk2 aguas abajo en condiciones normales y tratamiento con cisplatino (Fig. 3f, g). También pudimos observar el mismo fenómeno en las células 293T (Fig. 2d complementaria). Además, el inhibidor de la quinasa ATM KU-60019 podría reprimir parcialmente el aumento de la expresión de p-ATM, p-CHK1, p-CHK2 y p-H2A.X en las células de eliminación de C11orf54 tanto en condiciones de control como de tratamiento con cisplatino (Fig. 3h, i) . Estos datos sugieren que la eliminación de C11orf54 activa el daño del ADN en una vía dependiente de ATM.

La reparación del ADN es una vía conservada evolutivamente que puede reparar el daño del ADN de fuentes endógenas o exógenas para mantener la integridad genómica35,36. Nos preguntamos si C11orf54 regula la deficiencia en la reparación del ADN. En primer lugar, detectamos la expresión de Rad51 y Ku70, dos proteínas críticas en la recombinación homóloga (HR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ), respectivamente. Encontramos que la eliminación de C11orf54 reprimió significativamente la expresión de Rad51 pero no Ku70 (Fig. 4a, b), y los experimentos de inmunotinción mostraron la pérdida de C11orf54 inhibió la formación de focos de Rad51 en el núcleo (Fig. 4c, d), lo que indicó que C11orf54 puede ser participan en la recombinación homóloga. Por lo tanto, evaluamos la actividad de reparación de recombinación homóloga en células de control y eliminación de C11orf54 utilizando el sistema reportero HR. En este sistema, la GFP es interrumpida por el sitio I-SceI y la GFP funcional puede restaurarse mediante la reparación de recursos humanos utilizando la GFP descendente como plantilla después de la expresión de I-SceI37. Cotransfectamos pDR-GFP y pCBA-SceI en células de control y eliminación de C11orf54, y luego registramos las células positivas de GFP mediante citometría de flujo. Descubrimos que el porcentaje de células positivas para GFP se redujo significativamente en las células de eliminación de C11orf54 (Fig. 4e, f), lo que indica que la eliminación de C11orf54 suprimió la actividad de reparación de HR. Además, en comparación con las células de control, las células de eliminación de C11orf54 mostraron una eliminación más lenta de los focos p-H2A.X después de retirar el tratamiento con cisplatino (Fig. 4g, h). En conjunto, estos datos sugieren que la eliminación de C11orf54 afecta la reparación de la recombinación homóloga, lo que aumenta el daño del ADN.

a, b Transferencias de Western (a) y resultados cuantitativos (b) de las proteínas indicadas en control y células PLC/PRF/5 eliminadas de C11orf54 tras el tratamiento con cisplatino 10 μM durante 6 h (n = 3 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± DE;***p < 0,001). c, d Imágenes representativas de focos Rad51 (d) y resultados cuantitativos (c) en células de control y C11orf54 en el momento indicado después del tratamiento con cisplatino (n = 10 células independientes; los datos se presentan como valores medios ± SD; ** p < 0,01). Barra de escala = 10 μm. e, f Análisis de citometría de flujo (e) y resultados cuantitativos (f) de las células positivas para GFP en el control y células PLC/PRF/5 eliminadas de C11orf54 después de cotransfectar pDR-GFP y pCBA-SceI (n = 3 réplicas biológicas; *** p < 0,001). g, h Imágenes representativas de focos de p-H2A.X (g) y resultados cuantitativos (h) en células de control y C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 en el momento indicado después del tratamiento con cisplatino (n = 10 células independientes; los datos son presentados como valores medios ± DE; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Barra de escala = 10 μm.

Para identificar el mecanismo potencial del deterioro de la reparación de la recombinación homóloga mediada por la eliminación de C11orf54, analizamos los transcriptomas en las células de control y eliminación de C11orf54 mediante secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNA-Seq). Identificamos 708 genes expresados ​​​​diferencialmente significativos (303 genes regulados al alza y 405 genes regulados a la baja) en células de eliminación de C11orf54, que se visualizaron mediante la gráfica del volcán (Fig. 5a). Además, realizamos análisis funcionales de DEG (genes expresados ​​​​diferencialmente) utilizando la base de datos KEGG. Las 20 principales vías KEGG reguladas a la baja significativas se enumeraron en la Fig. 5b. La glucólisis / gluconeogénesis y la vía de señalización de HIF1 se regularon a la baja en las células de eliminación de C11orf54 (Fig. 5b). De manera consistente, los resultados de GSEA mostraron que los conjuntos de genes relacionados con la hipoxia (NES = -1.4, valor de p = 0.005) y la glucólisis-gluconeogénesis (NES = -1.5, valor de p = 0.011) estaban enriquecidos en el grupo pLKO.1 (Fig. 5c). HIF1A es un factor de transcripción conocido que regula la transcripción de la glucólisis y genes glucolíticos38. Por lo tanto, evaluamos la expresión de los genes diana de HIF1 y los genes asociados a la glucólisis/gluconeogénesis en las células de eliminación de C11orf54. Los resultados de la qPCR mostraron que la mayoría de los genes asociados con la glucólisis (GLUT1, GLUT2, PGK1, ENO1, PDK3, LDHA y PDHA1), así como los genes asociados con la gluconeogénesis (FBP1 y PEPCK), se redujeron significativamente en las células silenciadas C11orf54 (Fig. 5d). Además, la eliminación de C11orf54 reprimió significativamente el nivel de proteína de PKM2, HK2, LDHA, PFKP y HIF1A (Fig. 5e, f). Estos datos indican que la caída de C11orf54 suprime la vía de señalización de HIF1A.

un diagrama de volcán que muestra los genes significativamente modificados en la muestra de eliminación de C11orf54 frente a la muestra de control (punto rojo: genes regulados al alza, punto azul: genes regulados a la baja, punto gris: sin genes modificados significativos). b Las 20 vías principales de KEGG funcionalmente enriquecidas encontradas en el análisis de DEG en la muestra de eliminación de C11orf54 frente a la muestra de control. c El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) muestra que la vía de señalización de hipoxia y glucólisis-gluconeogénesis tiene una tendencia a enriquecer el grupo de eliminación de C11orf54. d Análisis del experimento de qPCR de la expresión de ARNm de los genes de glucólisis en células de control y silenciadas C11orf54 (n = 4 réplicas biológicas, los datos se presentan como valores medios ± DE, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). e, f Western blot (e) y resultados cuantitativos (f) de las proteínas de la glucólisis en células de control y de eliminación de C11orf54 (n = 4 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± DE, *p < 0,05, **p < 0,01 ).

A continuación, nos preguntamos qué objetivo aguas abajo de HIF1A estaba involucrado en la reparación del ADN en las células silenciadas C11orf54. Aunque la interacción entre la glucólisis y las vías de reparación del ADN sigue sin estar clara, varios estudios han sugerido que la glucólisis puede mantener la estabilidad del genoma al proporcionar metabolitos esenciales para el metabolismo del ADN39. Por ejemplo, la vía de las pentosas fosfato (PPP) convierte el intermediario de la glucólisis (glucosa-6-fosfato) en ribosa-5-fosfato para la síntesis de nucleótidos y NADPH para reducir el daño del ADN40,41. Por lo tanto, evaluamos la relación NADPH/NADP+ (un biomarcador bien conocido de PPP) y la expresión de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (la enzima limitante de la velocidad de PPP) en la célula de control y eliminación de C11orf54. Sin embargo, no hay diferencia en la proporción de NADPH/NADP+ y la expresión de G6PD entre las células de control y las de desactivación de C11orf54 (Fig. 4a, b complementarias), lo que sugiere que la desactivación del daño del ADN mediado por C11orf54 puede no pasar por la vía de la glucólisis.

Para investigar más a fondo cómo C11orf54 regula la reparación del daño del ADN, medimos los niveles de ARNm de los genes involucrados en la reparación del ADN. Como se muestra en la Fig. 6a, la mayoría de los niveles de transcripción de genes candidatos no cambiaron, excepto RRM2. Además, el nivel de proteína de RRM2 disminuyó significativamente en las células de eliminación de C11orf54 tanto en condiciones de cisplatino como de control (Fig. 6b, c). RRM2, la subunidad pequeña de la ribonucleótido reductasa, es esencial para la síntesis y reparación del ADN mediante la producción de dNTPs42. Se ha informado que la vía de señalización de HIF-1α/STAT3 podría aumentar el nivel transcripcional de RRM243,44. Por lo tanto, determinamos si la suplementación de nucleósidos podría rescatar el daño del ADN inducido por la caída de C11orf54. La suplementación de nucleósidos redujo parcialmente los focos de γ-H2AX en las células de eliminación de C11orf54 (Fig. 6d, e). Además, la formación de colonias suprimidas en las células de eliminación de C11orf54 también se restauró parcialmente mediante la suplementación con nucleósidos (Fig. 6f, g). Estos resultados sugieren que la caída de C11orf54 provoca daños en el ADN al suprimir el eje HIF1A/RRM2.

un análisis de qPCR de la expresión del ARNm de los genes diana de reparación del ADN aguas abajo de HIF1A en células de control y eliminación de C11orf54 (n = 4 réplicas biológicas, los datos se presentan como valores medios ± DE, ***p < 0,001). b, c Transferencias de Western (b) y resultados cuantitativos (c) de las proteínas indicadas en el control y en las células eliminadas de C11orf54 tras el tratamiento con cisplatino 10 μM durante 6 h (n = 4 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± DE, ** *p < 0,001). d, e Imágenes representativas de focos γH2A.X (d) y resultados cuantitativos (e) en células de control y de eliminación de C11orf54 tras el tratamiento con dNTP 100 μM durante 24 h. (n = 10 celdas independientes; los datos se presentan como valores medios ± DE; **p < 0,01, ***p < 0,001). Barra de escala = 10 μm. f, g La formación de colonias (f) y los resultados cuantitativos (g) muestran el crecimiento celular de la célula PLC/PRF/5 de eliminación de C11orf54 y las células de control bajo tratamiento con dNTP 100 μM durante 24 h (n = 3 réplicas biológicas; los datos se presentan como media valores ± DE, *p < 0,05, **p < 0,01).

A continuación, investigamos cómo C11orf54 regula la expresión de HIF1A. Dado que la eliminación de C11orf54 no afecta el nivel de ARNm de HIF1 (Fig. 6a), evaluamos la degradación de HIF1A. Primero, tratamos la célula con el inhibidor de PHD CoCl2, lo que resultó en la estabilización y acumulación de HIF1A. Sin embargo, la eliminación de C11orf54 disminuyó constantemente la expresión de HIF1A tras el tratamiento con CoCl2 (Fig. 5a complementaria), lo que sugiere que la eliminación de HIF1A reprimida por C11orf54 puede no ser a través de la regulación de la estabilización de HIF1A. Luego nos preguntamos si la eliminación de C11orf54 causa la degradación de HIF1A a través de la ruta del proteasoma o autofagia-lisosoma mediante el uso de MG132 y BafA1. Descubrimos que la expresión de HIF1A se restauró después del tratamiento con BafA1 pero no con MG132 (Fig. 7a, b). BafA1 es un inhibidor ampliamente utilizado para la fusión autofagosoma-lisosoma y la acidificación del autolisosoma, lo que sugiere que C11orf54 podría promover la degradación de HIF1A de una manera dependiente de la autofagia.

a, b Transferencias de Western (a) y resultados cuantitativos (b) de las proteínas indicadas en el control y en las células eliminadas de C11orf54 tras el tratamiento con MG132 10 μM y BafA1 100 nM durante 8 h (n = 4 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± DE, ***p < 0,001). c, d Transferencias de Western (c) y resultados cuantitativos (d) de las proteínas indicadas en el control y células de eliminación de C11orf54 con HBSS y tratamiento con rapamicina 1 μM durante 12 h (n = 4 réplicas biológicas; los datos se presentan como valores medios ± SD, *** p < 0,001). e, f Imágenes representativas (e) y resultados cuantitativos (f) de puntos GFP-LC3 en células de control y de eliminación de C11orf54 después de 48 h de transfección en condiciones normales y tratamiento con BafA1 100 nM durante 8 h. (Barra de escala = 20 μm; los datos se presentan como valores medios ± DE, *p < 0,05, ***p < 0,001). g El ensayo CCK8 muestra la supervivencia celular de las células PLC/PRF/5 de eliminación de C11orf54 y las células de control con un pretratamiento normal y BafA1 0,5 nM durante 12 h (los datos se presentan como valores medios ± SD, ***p < 0,001). h, i La formación de colonias (h) y los resultados cuantitativos (i) muestran el crecimiento celular de células PLC/PRF/5 de eliminación de C11orf54 y células de control con pretratamiento normal y BafA1 0,5 nM durante 12 h (n = 4 réplicas biológicas; se presentan datos como valores medios ± DE, **p < 0,05, ***p < 0,001).

De hecho, la eliminación de C11orf54 aumentó significativamente la proporción de LC3B-II / I y disminuyó el sustrato de autofagia p62 tras la inanición y el tratamiento con rapamicina (Fig. 7c, d). Además, la cantidad de puntos GFP-LC3 del autofagosoma aumentó en las células de eliminación de C11orf54 en condiciones normales y de tratamiento con BafA1 (Fig. 7e, f). Además, el pretratamiento con BafA1 podría restaurar la viabilidad celular y la capacidad de formación de colonias en las células silenciadas C11orf54 (Fig. 7g-i). Sin embargo, el tratamiento de los inhibidores de PI3K (Wortmannin y 3-MA), que reprimieron la fase temprana de la autofagia, no pudo restaurar el nivel de proteína de HIF1A en las células eliminadas de C11orf54 (Fig. 5b, c complementarias). Por el contrario, el tratamiento con un inhibidor lisosomal (NH4Cl) podría rescatar la expresión de HIF1A (Fig. 5d complementaria). Estos resultados sugieren que la eliminación de C11orf54 reduce la expresión de HIF1A durante la fase tardía de la autofagia y los lisosomas.

Un estudio reciente mostró que HIF1A contenía un motivo similar a KFERQ, que podría ser reconocido y unido por HSC70, y luego dirigido al complejo multimérico LAMP2A en el lisosoma para la degradación de la autofagia mediada por chaperonas (CMA)45. Por lo tanto, nos preguntamos si C11orf54 regula la degradación de HIF1A a través de la autofagia mediada por chaperonas. En primer lugar, detectamos la expresión de los componentes centrales de la maquinaria CMA (HSC70 y LAMP2A). Sin embargo, C11orf54 no afecta los niveles de ARNm y proteína de HSC70 y LAMP2A (Fig. 6a-d complementaria).

Luego especulamos que C11orf54 podría influir en la orientación de HIF1A al lisosoma y, posteriormente, a la degradación mediada por CMA. Por lo tanto, realizamos un ensayo de co-inmunoprecipitación/espectrometría de masas (Co-IP/MS) para identificar las proteínas que potencialmente interactúan con C11orf54 (Fig. 6e complementaria). La lista de proteínas de interacción C11orf54 más identificada se cargó en la base de datos en línea STRING para construir la red de interacción proteína-proteína (PPI). Luego, los genes centrales seleccionados de la red PPI utilizando el algoritmo de máxima centralidad de camarilla (MCC) y el complemento cytoHubba por el software Cytoscape se muestran en la Fig. 8a. Los 5 principales genes hubs fueron HSPA8, HSPA5, HSP90AA1, HSP90AB1 y HSPA9 (Fig. 8a, b). Tanto HSPA8 como HSP90AA1 se localizan en la membrana lisosomal, desde donde modulan diferentes pasos de CMA46. HSPA8 (HSC70) es responsable de la orientación del sustrato para CMA46. El ensayo de coinmunoprecipitación endógena confirmó que C11orf54 interactuaba con HSC70 pero no con LAMP2 (Fig. 8c). Además, mediante el software en línea KFERQ finder V0.8, reconocimos que C11orf54 contiene dos motivos similares a KFERQ, que pertenecen al motivo activado por fosforilación y al motivo activado por acetilación, respectivamente (Tabla complementaria 3). HIF1A contiene un motivo similar a KFERQ, que podría ser reconocido e interactuado por HSC70. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que C11orf54 y HIF1A interactúan competitivamente con HSC70. La interacción entre HIF1A y HSC70 se restringió en presencia de C11orf54 (Fig. 8d). Mientras tanto, la unión de HIF1A y HSC70 se debilitó con el aumento de la expresión de C11orf54 (Fig. 8e). Además, la interacción entre HIF1A y HSC70 se redujo en las células silenciadas C11orf54, posiblemente debido a la disminución de la expresión de HIF1A. Cuando se trató con BafA1, se rescató la expresión de HIF1A y su interacción con HSC70 (Fig. 8f). Además, la expresión de HIF1A se restauró mediante la doble eliminación de C11orf54 y LAMP2A (Fig. 8g). Juntos, estos datos demuestran que la eliminación de C11orf54 promueve la degradación de HIF1A mediada por CMA al mejorar la interacción entre HIF1A y HSC70.

a El análisis de la red de interacción proteína-proteína de las proteínas de unión a C11orf54 identificadas por Co-IP MS. b Espectro de masas de la imagen HSPA8. c Análisis de inmunoprecipitación/inmunotransferencia de lisados ​​de células completas (WCL) y Anti-C11orf54 derivados de células PLC/PRF/5. IgG sirvió como control negativo. d Análisis de inmunoprecipitación/inmunotransferencia de los lisados ​​de células completas (WCL) y Anti-Flag derivados de las células 293T transfectadas con Flag-HIF1A y Flag-HIF1A más pk-Myc-C11orf54 durante 48 h. IgG sirvió como control negativo (n = 3 réplicas biológicas). e Análisis de inmunoprecipitación/inmunotransferencia de los lisados ​​de células completas (WCL) y Anti-Flag derivados de las células 293T transfectadas con Flag-HIF1A, HA-HSC70 y gradiente pk-Myc-C11orf54 durante 48 h. IgG sirvió como control negativo (n = 3 réplicas biológicas). f Análisis de inmunoprecipitación/inmunotransferencia de los lisados ​​de células completas (WCL) y anti-HIF1A derivados de las células PLC/PRF/5 bajo control y tratamiento con BafA1 100 nM durante 8 h. IgG sirvió como control negativo (n = 3 réplicas biológicas). g Transferencias de Western de las proteínas indicadas en células de control, C11orf54 knockdown y C11orf54, LAMP2A double knockdown.

En este estudio, nuestro objetivo fue delinear un nuevo efecto biológico de C11orf54 en mamíferos. Demostramos que la eliminación de C11orf54 disminuyó la proliferación celular y mejoró el daño y la apoptosis del ADN inducidos por cisplatino. Mecánicamente, C11orf54 y HIF1A interactúan competitivamente con HSC70, el efector crítico de la autofagia mediada por chaperonas, y la eliminación de C11orf54 promueve la degradación de HIF1A mediada por CMA. Además, la degradación de HIF1A mediada por la eliminación de C11orf54 redujo la transcripción de la subunidad reguladora M2 de la ribonucleótido reductasa (RRM2), que es una enzima RNR limitante de la velocidad para la síntesis y reparación del ADN mediante la producción de dNTP. El suplemento de dNTP podría rescatar parcialmente el daño del ADN y la muerte celular mediados por la eliminación de C11orf54. Además, descubrimos que el inhibidor autofágico BafA1 podría rescatar el nivel de proteína de HIF1A y el nivel de ARNm de RRM2, luego restaurar la proliferación celular reducida de las células eliminadas de C11orf54. Por otro lado, la pérdida de C11orf54 redujo la expresión de Rad51 y la acumulación nuclear, lo que dio como resultado la supresión de la reparación por recombinación homóloga (Fig. 9).

Por un lado, la pérdida de C11orf54 reduce la expresión y la acumulación nuclear de Rad51. Por otro lado, la eliminación de C11orf54 promueve la unión de HSC70 a HIF1A para apuntar a la degradación a través de la autofagia mediada por chaperonas (CMA), lo que resulta en la regulación negativa de RRM2. Finalmente, la ausencia de C11orf54 provoca la supresión de la reparación por recombinación homóloga.

C11orf54 es un gen altamente conservativo en diferentes especies y es abundante en tejidos renales y hepáticos. El papel biológico de C11orf54 no estaba claro y la localización subcelular aún era controvertida. Conrado et al. reveló su ubicación nuclear mediante un enfoque de fenotipado automático27. Sin embargo, C11orf54 estaba predominantemente localizado en el citoplasma y, cuando se transfectaba con C11orf54-eGFP, podía existir tanto en el citoplasma como en el núcleo28. Aquí, probamos la localización de C11orf54 endógeno con dos anticuerpos verificados mediante el ensayo de fraccionamiento nuclear/citosólico y el análisis de inmunotinción. Los resultados indicaron que C11orf54 estaba ubicado principalmente en el citoplasma (Fig. 1d-g). C11orf54 se identificó como una proteína biomarcadora de cáncer de endometrio, carcinoma de células renales y carcinoma de células renales de células claras mediante electroforesis en gel bidimensional junto con espectrometría de masas24,25,26. Sin embargo, C11orf54 estaba regulado a la baja en tejidos de carcinoma de células renales en comparación con los tejidos normales correspondientes24,25,26. Además, al analizar la expresión de C11orf54 en varias muestras de tejido canceroso según los datos de TCGA utilizando el sitio web de GEPIA, encontramos que C11orf54 tenía una baja expresión en la mayoría de los tejidos cancerosos, especialmente en KICH (Kidney Chromophobe), KIRP (Kidney renal papilar cell carcinoma ) y SARC (sarcoma; figura complementaria 7). En nuestro estudio, la caída de C11orf54 podría causar daños en el ADN e inhibir la proliferación (Figs. 2-3). Estos sugieren que la expresión de c11orf54 disminuye en el tejido canceroso a través de un mecanismo desconocido, que puede ser un bucle de retroalimentación para bloquear la supervivencia de las células tumorales.

La recombinación homóloga (HR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ) son las principales vías para la reparación de DSB; Rad51 y Ku70 son dos reguladores clave, respectivamente47,48. En nuestro estudio, la caída de C11orf54 inhibe la expresión de Rad51 en lugar de ku70, lo que implica que C11orf54 puede influir en la reparación de HR. Utilizamos el sistema reportero HR y descubrimos que la caída de C11orf54 inhibía la capacidad de recombinación homóloga. Mientras tanto, la eliminación de los focos de p-H2A.X con el transcurso del tiempo de recuperación se inhibió después de la caída de C11orf54.

Los estudios proteómicos han demostrado que la proteína homóloga C11orf54 aumentó en el músculo esquelético de ratones con resistencia a la insulina, lo que sugiere que puede relacionarse con la vía de señalización de plegamiento/degradación de proteínas49. Nuestros resultados demuestran que la deficiencia de C11orf54 promueve la degradación del sustrato de macroautofagia p62 y la acumulación de LC3-II, lo que significa la activación de la macroautofagia (Fig. 6c-f). La vía de autofagia-lisosoma es una de las dos rutas principales para la degradación de proteínas intracelulares50.

Además, encontramos que la caída de C11orf54 promovió la degradación de HIF1A mediada por CMA (Fig. 7c-f). Mecánicamente, C11orf54 podría interactuar competitivamente con HSC70 para disociar la interacción HIF1A-HSC70. La eliminación de C11orf54 eliminó su interacción con HSC70, lo que resultó en una interacción mejorada entre HSC70 y HIF1A, lo que eventualmente promovió la degradación de HIF1A medicada con CMA (Fig. 8e, f). Consistentemente, un estudio previo mostró que HIF1A podría ser degradado por CMA al interactuar con HSC70 y LAMP2A45. Estudios previos mostraron que la macroautofagia y la autofagia mediada por chaperonas son complementarias en la degradación de proteínas51. Estudios recientes sugirieron que cuando las células se encuentran con estímulos estresantes, la macroautofagia y la CMA podrían activarse52,53. Aquí, demostramos que la pérdida de C11orf54 podría activar tanto la macroautofagia como la autofagia mediada por chaperonas, pero el mecanismo de cómo C11orf54 regulaba la autofagia aún no estaba claro, lo que necesita más estudio en el trabajo futuro.

Un estudio anterior reveló que la activación de la señalización de HIF1A/STAT3 podría aumentar la expresión del ARNm de RRM244, y también descubrimos que la inhibición de la degradación de HIF1A con BafA1 podría rescatar parcialmente a RRM2 a nivel de ARNm. El nivel de RRM2 fluctúa durante el ciclo celular, que aumenta durante la fase G1 tardía/S temprana y se degrada en la fase S tardía. Los niveles de RRM2 se controlan mediante la ubiquitina ligasa APCCdh1 para evitar la acumulación de RRM2 en la fase G154. Además, en la fase G2, luego de la fosforilación mediada por CDK, RRM2 se degrada a través de Cylin F55. Además, un estudio reciente mostró que la regulación a la baja de RRM2 por siRNA o el tratamiento con el inhibidor de RNR hidroxiurea indujo sustancialmente la autofagia. Sin embargo, RRM2 está dirigido a la degradación dependiente del proteasoma pero independiente del autolisosoma tras la inducción de la autofagia56. Nuestros resultados mostraron que la eliminación de C11orf54 redujo el nivel de RRM2 a través de la disminución del nivel de ARNm y proteína (Fig. 6a-c). El suplemento de dNTP no pudo rescatar la expresión de Rad51, pero pudo recuperar parcialmente el daño del ADN mediado por la eliminación de C11orf54 y la proliferación celular, lo que significa que podría haber un mecanismo alternativo que afecte la HR. Mientras tanto, la caída de C11orf54 promueve la autofagia (Fig. 7). La hidroxiurea es un inhibidor bien establecido de RNR al reducir los radicales libres y el centro de hierro de RRM257. En nuestro estudio, la hidroxiurea, la camptotecina y el cisplatino promueven la expresión de C11orf54 de manera dependiente del tiempo (Fig. 2f, g y Fig. 3a-d complementaria). Por lo tanto, cuál es la red de regulación exacta entre C11orf54, RRM2 y la autofagia también necesita más estudio.

En resumen, descubrimos un papel de C11orf54 en la regulación del daño y la reparación del ADN a través de la degradación de HIF1A mediada por CMA, lo que resulta en una reducción de RRM2. C11orf54 podría interactuar competitivamente con HSC70 y suprimir el objetivo de HIF1A para la degradación de CMA. El tratamiento con BafA1 o dNTP podría rescatar parcialmente el daño del ADN mediado por la eliminación de C11orf54 y la inhibición de la proliferación.

Las células PLC/PRF/5 y 293T se adquirieron del Shanghai Cell Bank, Type Culture Collection Committee, Chinese Academy of Sciences. Todas estas células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Hyclone) y penicilina-estreptomicina al 1 % (Gibco) a 37 °C bajo CO2 al 5 %.

Para el plásmido de sobreexpresión, el CDS C11orf54 se clonó a partir de ADNc de células 293T utilizando los cebadores de amplificación por PCR enumerados en la Tabla complementaria 1. El vector pk-Myc se digirió con BamHI y NotI para linealizar el vector y luego se ligó el CDS C11orf54 y el vector linealizado con ligasa T4 .

Para el diseño de shRNA, utilice BLOCK-iT™RNAi Designer (http://rnaidesigner.thermofisher.com/) para determinar dos objetivos de puntuación superior para C11orf54. Dos secuencias objetivo son las siguientes:

shC11orf54-1: 5′-GGTGCCCTACTGGAGAAATACA-3′;

shC11orf54-2: 5′-CCAGGTCTCTGTAGTTGATTG-3′.

El vector pLKO.1 se digirió con EcoRI y AgeI, y luego se ligó con oligos de ARNhc mediante la ligasa T4.

Para preparar lentivirus, cotransfectamos plásmidos shC11orf54 en células 293T con psPAX2 y pMD2.G, utilizando el reactivo de transfección de polietilenimina (PEI). Los sobrenadantes lentivirales se recolectaron a las 48 y 72 h después de la transfección, luego se infectaron células PLC/PRF/5 y 293T. Las células se seleccionaron en medio que contenía puromicina 1 μg/ml 3 días después de la infección.

El ARN total se extrajo de las células usando el regente RNAiso Plus (TaKaRa) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit de síntesis de primera cadena ABScript II (Abclonal) siguiendo las instrucciones del fabricante. La PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) se llevó a cabo con SYBR Green Master Mix (Abclonal) en un sistema en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). Los niveles relativos de ARNm se calcularon usando el método 2-ΔΔCt, usando Actb como control interno. Las secuencias de cebadores para los genes objetivo se muestran en la Tabla complementaria 1.

Las proteínas se aislaron en tampón RIPA enfriado con hielo (Beyotime) con inhibidores de proteinasa, y las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Las proteínas se fraccionaron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida, se sometieron a electrotransferencia sobre la membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (Millipore) y se probaron con anticuerpos primarios y secundarios. Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados se muestran en la Tabla complementaria 2. Las bandas de proteínas detectadas por los anticuerpos se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Beyotime) y se evaluaron utilizando Image J.

Las células se cultivaron hasta una confluencia del 60 % en un cubreobjetos. Después del tratamiento, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 20 min. La accesibilidad al antígeno aumentó con el tratamiento con Triton X-100 al 0,2 % y se bloqueó con albúmina sérica bovina al 3 %. Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Después de lavar con PBST, se tiñeron con IgG anti-conejo conjugada con Alexa Fluor 594 durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la tinción con DAPI, se tomaron imágenes de las células con un microscopio confocal Leica TCS SP8. Para la cuantificación de la colocalización, las imágenes se preprocesaron restando una imagen procesada con un filtro mediano y un fondo, y luego las imágenes procedieron con la Imagen J.

Los ensayos de fraccionamiento nuclear/citosólico se realizaron utilizando el kit de extracción de proteínas citoplasmáticas y nucleares (Beyotime) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 2 × 106 células se agitaron con el Reactivo A de extracción de citoplasma durante 5 sy se incubaron en hielo durante 15 min. Se añade el Reactivo B de extracción de citoplasma y se incuba en hielo durante 1 min después de 5 s en vórtice, luego se centrifuga a 4 °C durante 5 min a 12 000 g. El sobrenadante fue fraccionamiento citosólico. Luego, el sedimento nuclear se lavó tres veces con PBS helado y se resuspendió con reactivo de extracción nuclear y luego se agitó cada 2 min durante 30 s durante un total de 30 min. Se centrifugó a 4 °C durante 10 min a 12 000 g, y el sobrenadante se fraccionó nuclearmente.

Se sembraron células PLC/PRF/5 y 293T en placas de 10 cm y se transfectaron con los plásmidos indicados. Dos días después de la transfección, las células se lisaron con tampón Western/IP en hielo y luego se sonicaron. Las concentraciones de proteína se determinaron en el ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Se usaron anticuerpos Flag o HIF1α para inmunoprecipitar HSC70 endógeno. Los precipitados se hirvieron y se cargaron en geles SDS-PAGE para transferencia Western con anticuerpo secundario VeriBlot para detección IP.

La apoptosis celular se evaluó mediante citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis de Annexin V-FITC (Beyotime) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, después del tratamiento, las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS, se resuspendieron en tampón de unión y se incubaron con solución de tinción (anexina V/PI = 2:1) en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la tinción con anexina V/PI, se realizó un análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando BD FACS VERSE.

La tinción TUNEL se realizó utilizando el kit de ensayo de apoptosis TUNEL de un paso (Beyotime) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, después de 24 h de tratamiento con cisplatino, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 min y luego se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % durante 5 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, incubar las células con la solución de prueba TUNEL (tampón de marcaje/enzima TdT = 9:1) en la oscuridad durante 60 minutos a 37 °C. Finalmente, se tomaron imágenes de las células con Zeiss Axio Imager.Z2.

Se utilizó CCK-8 (Solarbio) para evaluar la proliferación celular siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 103 células/pocillo, luego se cultivaron en una incubadora durante 24 h antes de evaluarse en el día 1, -2, -3, -4, -5, respectivamente. . A continuación, la solución de CCK-8 se goteó en cada pocillo y la placa se transfirió a la incubadora durante dos horas. Finalmente, MD SpectraMax 190 detectó un valor de DO a 450 nm.

Aproximadamente 1 × 103 células pLKO.1 y shC11orf54 PLC/PRF/5 se sembraron en una placa de seis pocillos y se trataron con la concentración indicada de cisplatino. Las células se cultivaron durante 10 días y se usó paraformaldehído al 4 % para fijar las células, seguido de tinción con cristal violeta al 0,5 % durante 1 hora. El número de colonias (> 50 células/colonia) se contó usando un microscopio estereoscópico y se analizó con el software image J58. Todas las muestras se realizaron por triplicado.

La tinción de EdU se realizó con el kit BeyoClick™ EdU-594 (Beyotime) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadió EdU 10 μM al medio fresco y luego se incubó durante 2 horas a 37 °C/CO2 al 5 % cuando las células crecieron hasta una confluencia del 80 %. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, las células se incubaron con tampón de reacción en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción con DAPI, se tomaron imágenes de las células con Nikon Ti2 para visualizar el número de células positivas para EdU. La tasa positiva fue determinada por Image Pro Plus 6.

Los ensayos Comet se realizaron como en nuestro estudio anterior utilizando el kit de ensayo COMET (Enzo) siguiendo las instrucciones del fabricante59. Combine las células a 1 × 105/ml con agarosa LM fundida en una proporción de 1:10 (vol/vol) y pipetee inmediatamente en un portaobjetos COMET. Se colocaron los portaobjetos planos a 4 °C en la oscuridad durante 30 min y luego se sumergieron en la solución de lisis preenfriada a 4 °C durante 30 min. Se retiraron los portaobjetos, se tapó con cinta adhesiva el exceso de tampón de los portaobjetos, se lavaron en tampón TBE y luego se transfirieron a una cámara de electroforesis horizontal. Se aplicó voltaje (1 V/cm) durante 10 min. Retire con mucho cuidado el exceso de TBE, sumerja los portaobjetos en etanol al 70 % durante 5 minutos y seque las muestras al aire. Los portaobjetos se tiñeron con SYBR Green y luego se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. En total, se evaluaron entre 70 y 150 células en cada muestra utilizando el proyecto de software de ensayo COMET (software CASP). % de ADN de la cola = ADN de la cola/ (ADN de la cola + ADN de la cabeza), Momento de la cola = Longitud de la cola × % de ADN de la cola

El ensayo de actividad de reparación de HR se realizó como el estudio anterior37. Brevemente, se transfectaron células pLKO.1 y shC11orf54 PLC/PRF/5 con pDR-GFP y pCBA-SceI. Después de dos días, las células se recolectaron y analizaron mediante citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) para examinar el porcentaje de células positivas para GFP. Las estrategias de activación se muestran en la Fig. 8 complementaria.

El ARN total se extrajo de las células pLKO.1 y shC11orf54 PLC/PRF/5. Luego, el ARN fue secuenciado por el servicio WuXiNextCODE Tec RNA-seq (n = 2). El análisis GO de los cambios significativos de los genes expresados ​​diferencialmente se realizó utilizando el sitio web de Metascape (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)60. Para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes, aplicamos GSEA v4.1.0 a varias firmas de genes de características funcionales como se describió anteriormente61,62. GSEA se realizó utilizando los conjuntos de genes "Hallmark" o "KEGG" para identificar firmas enriquecidas. Los conjuntos de genes con un FDR <0,25 y un valor p nominal de <0,05 se consideraron significativos.

Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DE). El nivel de significación estadística se fijó en p < 0,05 usando una prueba t de Student de dos colas para datos no apareados. *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. El tamaño de la muestra y las réplicas se indicaron en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-seq generados en este estudio se han depositado en la base de datos Sequence Read Archive (SRA) con el código de acceso PRJNA939822, ID de muestra: SRR23648017, SRR23648018, SRR23648019 y SRR23648020. Los geles de western blot sin editar/sin recortar se incluyen en la figura complementaria 9. Los datos de origen detrás de los gráficos en el documento se incluyen en los datos complementarios 1. Todos los demás datos están disponibles de los autores correspondientes a pedido razonable.

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Agradecemos al Dr. Guo Chen de la Universidad de Jinan por los plásmidos pDR-GFP y pCBA-SceI. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFA0804903), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones 32170772, 32270810, 81800833 y 81802189), el Proyecto 111 (B16021) y la Fundación de Ciencias Naturales de Provincia de Guangdong (subvención 2021A1515011227, 2022A1515140040, 2019A1515011847 y 2019A1515010591). QZ también agradece el apoyo de KC Wong Education Foundation.

Estos autores contribuyeron igualmente: Junyang Tan, Wenjun Wang.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Jianshuang Li, Qinghua Zhou.

El Sexto Hospital Afiliado de la Universidad de Jinan, Universidad de Jinan, 523573, Dongguan, Guangdong, China

Junyang Tan, Wenjun Wang, Xinjie Liu, Jinhong Xu, Yaping Che, Yanyan Liu, Jiaqiao Hu, Liubing Hu, Jianshuang Li y Qinghua Zhou

Instituto de Investigación Traslacional Biomédica, Centro de Ciencias de la Salud (Facultad de Medicina), Universidad de Jinan, 510632, Guangzhou, Guangdong, China

Junyang Tan, Wenjun Wang, Xinjie Liu, Jinhong Xu, Yaping Che, Yanyan Liu, Jiaqiao Hu, Liubing Hu, Jianshuang Li y Qinghua Zhou

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El proyecto fue supervisado por JL y QZ Los experimentos fueron diseñados por JL y QZ, realizados por JT, WW, XL, JX, YC, YL, JH y LH; JT, WW y JL analizaron los datos. JT, WW, JL y QZ escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Jianshuang Li o Qinghua Zhou.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Christina Karlsson Rosenthal. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Tan, J., Wang, W., Liu, X. et al. C11orf54 promueve la reparación del ADN bloqueando la degradación de HIF1A mediada por CMA. Comun Biol 6, 606 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04957-1

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Recibido: 23 de septiembre de 2022

Aceptado: 19 de mayo de 2023

Publicado: 05 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04957-1

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